李玲玉，李雨晨，左兆河，田寶蘭，鄭振佳*

(1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院 山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 泰安 271018；2. 山東醫(yī)藥技師學(xué)院，山東 泰安 271000；3. 山東植益源健康科技有限公司，山東 泰安 271000)

菊糖(inulin)是一種直鏈結(jié)構(gòu)多糖，由D-呋喃果糖經(jīng)β(2→1)糖苷鍵聚合而成，其還原端末端帶有一分子葡萄糖，聚合度在2～60[1]。菊糖廣泛分布于植物、微生物和真菌中，其中菊科和桔?？浦参镏泻坑葹樨S富[2-4]。菊糖具有降血糖、降血脂、調(diào)節(jié)腸道菌群、抗癌等多種生理活性，同時(shí)也可作為天然質(zhì)構(gòu)劑應(yīng)用于生產(chǎn)巧克力、奶酪、肉餡、面條等多種食品及菊糖系列保健品等諸多領(lǐng)域[5-9]。研究發(fā)現(xiàn)菊糖的生理活性和加工特性與菊糖聚合度密切相關(guān)。例如，Padalino等[10]發(fā)現(xiàn)與低聚合度的菊粉相比，在意大利面中添加高聚合度菊粉后，面條的總膳食纖維顯著增加，有效碳水化合物和淀粉消化率含量降低；Luo等[11]發(fā)現(xiàn)高、中、低三種聚合度的菊粉均可以延緩淀粉的老化，但低聚合度菊粉效果最好。然而植物來(lái)源、收獲季節(jié)、氣候、土壤以及生產(chǎn)加工過(guò)程等各個(gè)因素均會(huì)對(duì)聚合度產(chǎn)生影響[12]。高效凝膠色譜法是利用凝膠粒徑來(lái)排阻特定大小分子的方法，按照樣品的分子量大小對(duì)其分級(jí)，大分子通過(guò)凝膠柱時(shí)被完全排阻在填料網(wǎng)孔之外先流出，小分子則穿過(guò)填料網(wǎng)孔溶劑中后流出[13]。該方法具有高效、快速、靈敏度高等特點(diǎn)，目前常被用于研究多聚合物的相對(duì)分子量及分布的測(cè)定，逐漸應(yīng)用于多糖、蛋白和樹(shù)脂等多種聚合物中[14]。

本文建立了一套高效凝膠過(guò)濾色譜測(cè)定相對(duì)分子量的方法，將系列不同分子量的葡聚糖樣品配制后，進(jìn)入高效凝膠色譜系統(tǒng)，將測(cè)得的響應(yīng)值和出峰時(shí)間的譜圖用GPC軟件處理，繪制分子量和出峰時(shí)間關(guān)系曲線，并且利用該方法對(duì)菊苣、菊芋和牛蒡三種批次農(nóng)產(chǎn)品提取的菊糖分子量進(jìn)行檢測(cè)。本研究為天然菊糖活性研究及菊糖產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)與市場(chǎng)開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

LC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司)，配有四元泵、示差檢測(cè)器(refraction index detector-10A，RID-10A)、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器等；SCIENTZ-12N冷凍干燥機(jī)(寧波新芝生物科技有限公司)；T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)。

OHpak SB-802.5 HQ色譜柱(8 mm×300 mm，6 μm，日本Shodex公司)。

葡聚糖(342 D、1000 D，2000 D，5000 D，6000 D，試劑純，上海源葉生物公司)；無(wú)水乙醇、苯酚、正丁醇、硝酸鈉、氯仿等(分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)；濃硫酸(優(yōu)級(jí)純，濟(jì)南試劑總廠)；果糖(優(yōu)級(jí)純，北京索萊寶科技有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

菊芋、菊苣和牛蒡的干切片，分別編號(hào)為a、b、c，其中菊芋a-1、a-2和a-3產(chǎn)地分別為江蘇徐州、河北衡水和福建寧化；菊苣b-1、b-2和b-3產(chǎn)地均為吉林長(zhǎng)白山；牛蒡c-1、c-2和c-3分別為江蘇徐州的白肌、柳川理想和山東臨沂的黑皮牛蒡。

2 方法與結(jié)果

2.1 菊糖樣品制備

2.2 菊糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

以果糖為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照糖，采用苯酚-硫酸法測(cè)定樣品中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)[17-19]。以果糖濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度OD490nm為縱坐標(biāo)，繪制果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.007 4X-0.002 3,R2=0.999 4，糖濃度在20～100 μg/mL時(shí)與吸光度具有良好的線性關(guān)系。

2.3 分子量的測(cè)定

參照李琬聰?shù)萚20]和Chen等[21]的方法測(cè)定菊糖分子量。

2.3.1 高效液相色譜條件

色譜柱：凝膠色譜柱OHpak SB-802.5 HQ (8 mm×300 mm，6 μm)；示差折光檢測(cè)器：RID-10A；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相0.3 mol/L硝酸鈉溶液和水，以0.3 mL/min的流速對(duì)菊糖樣品c-1進(jìn)行分析，液相色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 c-1樣品高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatography of c-1

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合

本研究考察了一次方程到五次方程的擬合形式，用標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值為衡量標(biāo)準(zhǔn)。依據(jù)2.3.1高效液相色譜條件進(jìn)樣，分別配制5.0 mg/mL的葡聚糖(分子量為6000 D、4000 D、2000 D、1000 D和342 D)，并用0.22 μm的水系濾頭過(guò)濾，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=-0.001 718 157X3+0.1 504 561X2-4.498 484X+48.71 874，R2=0.999 9，見(jiàn)圖2。

圖2 不同分子量糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of dextran with different molecular weights

2.3.3 菊糖聚合度測(cè)定

將樣品配制為5.0 mg/mL，使用0.22 μm的水系濾頭過(guò)濾。按照標(biāo)準(zhǔn)樣品的條件進(jìn)樣，獲得樣品的出峰時(shí)間和強(qiáng)度分布圖，將該結(jié)果帶入GPC軟件擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算菊糖相對(duì)分子質(zhì)量，進(jìn)而檢測(cè)菊糖聚合度。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 準(zhǔn)確性

取葡聚糖對(duì)照品(342 D、2000 D和6000 D)各3份，按照1.3.3的處理方法，重復(fù)進(jìn)樣3次，將GPC軟件計(jì)算得到的相對(duì)分子質(zhì)量與已知標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量的葡聚糖為對(duì)照，利用相對(duì)誤差衡量標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確度。將保留時(shí)間帶入GPC軟件擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，可得葡聚糖對(duì)照品(342 D)的相對(duì)分子量分別為342 D、343 D和344 D，相對(duì)誤差分別為0、0.29%和0.58%；葡聚糖對(duì)照品(2000 D)的分子量分別為1989 D、1993 D和2003 D，相對(duì)誤差分別為0.55%、0.35%和0.15%；葡聚糖對(duì)照品(6000 D)的分子量分別為5972 D、6013 D和6044 D，相對(duì)誤差分別為0.47%、0.22%和0.73%，說(shuō)明該葡聚糖對(duì)照品準(zhǔn)確度較好。

2.4.2 重復(fù)性

取多糖樣品(a-1、b-2和c-3)各3份，按照1.3.3的處理方法，重復(fù)進(jìn)樣3次，將測(cè)得的3組菊糖保留時(shí)間代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計(jì)算三種樣品重均分子量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。根據(jù)GPC軟件計(jì)算得到多糖樣品的重均分子量。其中a-1的相對(duì)分子量為1762 D、1786 D和1791 D，平均值為1 780 D，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.87%；b-2為3992 D、4000 D和3996 D，平均值為3996 D，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.01%；c-3為2290 D、2296 D和2294 D，平均值為2293 D，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.13%，說(shuō)明重復(fù)性良好。

2.5 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)采用GPC軟件計(jì)算多糖的平均分子量Mw，重復(fù)3次，并按照公式(Mw=162 DP+18)[22]，計(jì)算菊糖聚合度。利用Excel 2016 和Origin 9.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

采用建立的測(cè)定方法分別分析了9批植物樣品的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)和相對(duì)分子量，并計(jì)算得到9批樣品的聚合度，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，本次選取的9個(gè)樣品的菊糖聚合度在10～29，不同品種，同一品種不同批次菊糖聚合度均有不同程度的差異。

表1 菊糖聚合度及多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 1 Inulin polysaccharide content and polymerization degree

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

3.1.1 流動(dòng)相的選擇

從圖1中 c-1樣品分子量液相圖可以看出，以0.3 mol/L硝酸鈉溶液(a)和純水作流動(dòng)相(b)出峰時(shí)間和響應(yīng)值差別不大，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差控制在10%以內(nèi)(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為9.41%)，但前者作流動(dòng)相測(cè)定菊糖分子量基線更為平穩(wěn)，后者會(huì)出現(xiàn)基線漂移，因此該方法選用0.3 mol/L硝酸鈉溶液為流動(dòng)相。

3.1.2 流速的選擇

菊糖分析過(guò)程可通過(guò)降低流速實(shí)現(xiàn)提高分離效果的目的，同時(shí)流速的降低也會(huì)使峰寬增大造成保留時(shí)間變長(zhǎng)[23]。該色譜柱在鹽濃度0.2～0.5 mol/L時(shí)，置換流量為0.3 mL/min，該流速下目標(biāo)組分分離效果較好，因此選擇0.3 mL/min的流速為分析流速。

3.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合形式的選擇

分別考察了一次到五次方程擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示三次方程擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合度最好，滿足分析要求，相關(guān)系數(shù)R2>0.999，其他冪次擬合的方程R2值低于0.98，可行性低于三次方程擬合，因此選擇三次方程擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.2 結(jié)論

本研究建立了一套菊糖分子量的檢測(cè)方法，其中色譜柱為OHpak SB-802.5 HQ，進(jìn)樣量為20 μL，溫度30℃，流動(dòng)相為0.3 mol/L硝酸鈉溶液，流速為0.3 mL/min，利用GPC 軟件繪制三次標(biāo)準(zhǔn)曲線及計(jì)算分子量。本研究從3種菊科植物3個(gè)批次提取的菊糖分子量檢測(cè)結(jié)果看，9個(gè)樣品聚合度有不同程度的差異，不同品種及同一品種不同批次即使在提取條件完全相同時(shí)菊糖的聚合度也會(huì)不同，同時(shí)本研究建立的方法的相對(duì)誤差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別控制在0.73%和0.87%，準(zhǔn)確性和重復(fù)性較好。該方法可以直接應(yīng)用到菊糖實(shí)際生產(chǎn)中，為后期功能性菊糖的開(kāi)發(fā)及品質(zhì)控制、食品工業(yè)上菊糖作為添加劑的篩選、不同產(chǎn)地或不同品種菊科植物產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)、不同儲(chǔ)藏期菊糖分子量的研究等提供新思路。