時桂芹，沈佳鑫，任 菲，韓亞偉

鄭州輕工業(yè)大學，鄭州市金水區(qū)東風路5 號 450002

卷煙煙氣化學成分非常復雜，其中含有一些對吸煙者有潛在風險的有害成分，例如煙草特有亞硝胺（TSNAs），在此類化合物中，4-（甲基亞硝氨基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK）的含量較高，致癌性較強，已被國際癌癥研究機構（International Agency for Research on Cancer，IARC）列為一類致癌物［1-5］。據(jù)報道，氧化損傷在NNK 誘導腫瘤發(fā)生過程中扮演著重要角色，而抗氧化蛋白Prx（Peroxiredoxin）最重要的功能是通過調(diào)節(jié)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）水平使機體免受氧化損傷，在腫瘤中表達異常的一些Prx 蛋白可能成為某些腫瘤的標志物［6］。因此，研究NNK 等環(huán)境致癌物對Prx基因表達的影響具有重要意義。

在小鼠體內(nèi)NNK 可通過α-亞甲基羥基化反應與DNA 結(jié)合生成DNA 加合物，進而使機體發(fā)生癌變［7］。李琛等［8］研究表明，NNK 致癌的小鼠肺、肝臟等器官組織中形成了DNA 甲基化產(chǎn)物O6-甲基鳥嘌呤（O6-mG）。有報道表明，許多疾病及癌癥的發(fā)生都與機體的免疫系統(tǒng)損傷有關［9］。在哺乳動物中Prx家族蛋白含有Prx1～Prx6等6種蛋白［10］，是一類在機體內(nèi)廣泛存在的抗氧化酶，其能有效清除細胞內(nèi)的ROS，從而使細胞內(nèi)的ROS 水平保持平衡［11］。Prx 家族蛋白對調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡和免疫反應、抗腫瘤等具有重要影響［12］。自由基導致的氧化應激和損傷與腫瘤的發(fā)生有關，而Prx 蛋白最為顯著的功能是清除過氧化物，同時氧化應激可以誘導Prx 的表達，這表明Prx 與ROS 的生成相關［13］。通常，在各種氧化應激條件下，Prx 與氧化應激的衰減和細胞存活的增加有關，Prx 基因也被認為是細胞內(nèi)H2O2的受體，而H2O2具有重要的第二信使功能，因此，Prx 基因在多種生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用［14］。近年來，Prx 在腫瘤預防中的作用已被證實，但也有報道稱Prx 可能與促進癌癥的發(fā)生有關，因此，Prx 基因在腫瘤發(fā)生中的確切作用仍有爭議。有研究表明，卷煙煙氣、NNK和砷酸鹽等可以通過激活蛋白激酶C、絲裂原活化 蛋 白 激 酶（Mitogen activated protein kinase，MAPK）和p38 MAPK 途徑刺激2-Cys Prx 基因的表達［15］。目前，NNK 對Prx 基因體內(nèi)表達的誘導作用以及對腫瘤發(fā)生的影響尚不清楚。有關NNK誘導的癌癥與機體免疫系統(tǒng)損傷，以及Prx 基因差異表達的研究較少［16］。因此，通過對小鼠進行NNK 腹腔注射，綜合評價NNK 對小鼠的毒性和Prx 基因表達的影響，旨在為NNK 致癌性研究和腫瘤靶向治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

SPF 健康清潔KM 雄性小鼠，6 周齡，體質(zhì)量33～37 g，由河南省實驗動物中心提供。環(huán)境適應期為7 d［溫度（22±2）℃，相對濕度40%～75%］，自由飲水和攝食。觀察1 周后，選擇健康小鼠進行分組和NNK 染毒實驗。

NNK （＞98% ，加 拿 大TRC 公 司）；乙 醇（100%）、甲醛（＞99%）、甲醇（99%）（青島玉洲化工有限公司）；氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、二甲苯（＞99%，上海源葉生物科技有限公司）；生物切片石蠟（＞99%，上海華靈康復器械廠）；蘇木精染液、伊紅染液（＞99%，北京中西遠大科技有限公司）；中性樹膠（上海標本模型廠）；Trizol 試劑和反轉(zhuǎn)錄試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］；實時熒光定量PCR 試劑盒［寶生物工程（大連）有限公司］；其余均為市售分析純試劑。

Observer A1 倒置顯微鏡（德國Zeiss 公司）；ERM3100 組織切片機及配套刀片（上海精密儀器儀表有限公司）；Stepone Plus 熒光定量PCR（美國ABI 公司）；5810/5810R 高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；PL4002 電子天平［感量：0.1 mg，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；Option-S7/15 純水機（英國ELGA 公司）；GZX-DH-202-BS 電熱恒溫干燥箱（上海賀德實驗設備有限公司）；LX-C35L 立式壓力蒸汽滅菌鍋（合肥華泰醫(yī)療設備有限公司）；DW-86L386 超低溫冰箱（-80 ℃，青島海爾特種電器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物的分組染毒、觀察及數(shù)據(jù)統(tǒng)計

選擇健康雄性小鼠60 只，體質(zhì)量30～35 g。隨機分成A～D 4 組，每組15 只。具體為：A. 2.5 mg/kg NNK處理組，B. 5.0 mg/kg NNK處理組，C. 2.5 mg/kg生理鹽水對照組，D. 5.0 mg/kg 生理鹽水對照組。采用等體積腹腔注射（0.5 mL/只）給藥，NNK 處理組于初次腹腔注射給藥24 h 后進行等劑量再次給藥。每間隔24 h 腹腔注射1 次，直到注射24 周后斷頸處死小鼠。每隔2～3 d 給小鼠添加飼料，更換飲用水，并且清理更換鋸末墊料。小鼠從購買期到注射期之間的時間間隔為適應期，適應期為7天，在注射期及正常飼養(yǎng)期間，每天觀察小鼠一般形態(tài)（打斗行為、精神狀態(tài)、皮毛顏色和光澤以及分泌物等）。另外，每周統(tǒng)計1 次各組小鼠的平均進食量，每月稱量1 次小鼠的體質(zhì)量，每組10 只小鼠，計算平均值。

1.2.2 組織切片的制作與HE 染色

從各組隨機抓取3 只小鼠，斷頸處死后用鑷子小心取出肝臟、肺、腎臟、睪丸，將每種組織用生理鹽水清洗3～5 遍，用剪刀剪下約0.5 cm 尺寸的組織，置于10%中性緩沖福爾馬林溶液中進行固定，用于后期的組織切片制作，其余組織于-80 ℃冰箱中保持，用于總RNA的提取。將各種組織剪成約0.5 cm 厚度的小塊，用石蠟進行包埋，制成約4 μm的組織切片，用于HE 染色。取出各種組織器官，依次進行乙醇梯度脫水、石蠟包埋、常規(guī)切片、HE染色，最后將切片置于倒置顯微鏡下進行觀察［17］。

1.2.3 RNA 的提取及Prx 基因表達的熒光定量PCR 檢測

分別用Trizol 試劑提取處理組和對照組小鼠器官組織的RNA，按照操作說明得到白色沉淀，加入40 μL 0.01%焦碳酸二乙酯（DEPC），使RNA 完全溶解。采用紫外分光光度計法分別測定RNA在260 和280 nm 下的吸光度，并計算其比值。將各種組織的總RNA 用DEPC 調(diào)節(jié)至相同濃度，并進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應步驟為：

①取試劑盒中需要用的試劑，混勻后置于冰上保存。②按照反轉(zhuǎn)錄說明書中步驟進行操作，配制反應液（表1），并將其加入無菌、無RNase 的EP 管中，混勻后離心。③放入PCR 儀中，設定程序為：25 ℃，10 min；42 ℃，30 min；85 ℃，5 min，終止反應。將PCR 產(chǎn)物稀釋后于-20 ℃保存。實時熒光定量PCR 是以GAPDH 為內(nèi)參基因，基因引物序列見表2。④熒光定量PCR 反應條件。取20 μL 不同反應溶液（表3），混勻，離心，置于PCR 儀中進行反應。設置的程序為：a. 變性溫度95 ℃，時間30 s；b. 循環(huán)擴增40 次，變性溫度95 ℃、時間5 s，退 火 溫 度58～60 ℃、時 間30 s；延 伸 溫 度72 ℃、時間30 s；c. 延伸溫度72 ℃，時間5 min。

根據(jù)Ct 值計算內(nèi)參基因和處理組基因的△Ct，由△Ct對照組-△Ct處理組得到△△Ct，根據(jù)2-△△Ct得出處理組樣本基因相對于對照組樣本基因的表達量。

表1 逆轉(zhuǎn)錄反應體系Tab.1 Reverse transcription reaction system

表2 Prx 基因的引物序列Tab.2 Primers for Prx genes

表3 qRT-PCR 反應體系組成Tab.3 Composition of qRT-PCR reaction system

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

應用SPSS 17.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。實驗數(shù)據(jù)用均值±標準差表示，用單因素方差分析（ANOVA）進行組間比較，檢驗水準為α=0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 小鼠形態(tài)學分析

在本實驗中，由形態(tài)學分析可知，A 組（2.5 mg/kg NNK 處理組）小鼠的毛發(fā)粗糙散亂、光澤稍顯暗淡，行為表現(xiàn)焦慮，觸碰時有撕咬行為，但尿液和糞便無異常。B 組（5.0 mg/kg NNK 處理組）小鼠的行為表現(xiàn)同A 組，但與A 組相比，小鼠毛發(fā)更加粗糙散亂、無光澤，在觸碰時更顯焦慮，而尿液和糞便無異常。C 組（2.5 mg/kg 生理鹽水對照組）小鼠尾巴表明有打斗痕跡，其他均無異常。D組（5.0 mg/kg 生理鹽水對照組）小鼠與C 組小鼠相同?？傮w上，對小鼠進行腹腔注射NNK，會使小鼠侵略性、好斗性增強，并使其毛發(fā)變得粗糙。

2.2 小鼠進食量與體質(zhì)量分析

小鼠月均進食量（圖1）顯示，4 組小鼠月平均進食量均先上升后降低，這可能是由于前兩個月小鼠處于快速生長時期，因此進食量較大。在注射NNK 第1 個月至第5 個月，處理組小鼠進食量明顯比對照組大。這可能是由于處理組小鼠代謝NNK 需要消耗較多能量，因此進食量比對照組大。從注射NNK 第5 個月開始，B 組小鼠進食量超過其他3 個組，可能的原因是經(jīng)過4 個月的NNK腹腔注射，小鼠已適應NNK 處理，但B 組小鼠需要代謝更多的NNK，機體消耗能量多，因而進食量較大。

小鼠月均體質(zhì)量（圖2）顯示，小鼠在適應期平均體質(zhì)量約34 g。在注射NNK 和生理鹽水期間，處理組小鼠的體質(zhì)量先增加后降低。但對照組小鼠體質(zhì)量一直處于增加趨勢。盡管4 組小鼠進食量差異不大，但是隨著NNK 注射時間的延長，處理組小鼠的體質(zhì)量有所降低，對于5.0 mg/kg NNK處理組，變化更加明顯。

圖1 小鼠月均進食量Fig.1 Monthly average food intake of mice

圖2 小鼠月均體質(zhì)量Fig.2 Monthly average body weight of mice

2.3 組織切片制作與HE 染色分析

小鼠肺組織切片見圖3。圖3A 是2.5 mg/kg NNK 處理組小鼠肺組織細支氣管，可以看出，肺泡隔出現(xiàn)增生、膨大，HE 著色較深并伴有溶血，有炎癥細胞的浸潤反應，結(jié)締組織存在被破壞現(xiàn)象，黏膜上皮有脫落，黏膜下層平滑肌斷裂，部分黏膜已無法識別。而對照組小鼠肺泡隔色澤健康完整，氣道壁結(jié)構完好，平滑肌連續(xù)（圖3C）。與對照組小鼠（圖3D）相比，5.0 mg/kg 的NNK 處理組小鼠（圖3B）肺泡隔出現(xiàn)輕微增生，著色略深，部分肺泡囊被破壞，但沒有A 組嚴重，肺泡隔同樣有增生，且伴有炎癥反應。

圖3 小鼠肺組織的HE 染色效果圖（400 倍）Fig.3 HE staining images of mouse lung tissues（400 times）

小鼠肝組織切片見圖4。圖4A 是2.5 mg/kg NNK 處理組小鼠肝小葉組織，與對照組小鼠（圖4C）相比，中央靜脈組織完整、清晰可見，內(nèi)部有少量血紅細胞；肝索清晰，肝血竇數(shù)量較多，并且比較大，肝血竇中間有少量顆粒物；枯否細胞伸出偽足附著于內(nèi)皮細胞表面，肝細胞與其細胞核明顯增大。與對照組小鼠（圖4D）相比，5.0 mg/kg NNK 處理組小鼠（圖4B）肝小葉中央貫穿中央靜脈，肝細胞向四周呈放射狀排列，形成肝索；肝板之間的空隙內(nèi)有若干肝血竇，中間夾雜一些巨噬細胞。

圖4 小鼠肝組織的HE 染色效果圖（200 倍）Fig.4 HE staining images of mouse liver tissues（200 times）

小鼠腎組織切片見圖5。圖5A 是2.5 mg/kg NNK 處理組小鼠腎臟組織腎皮質(zhì)，與對照組小鼠（圖5C）相比，腎小球出現(xiàn)萎縮、變形，腎小囊腔變窄；腎小球內(nèi)的足細胞分布松散不緊密，部分腎小管管壁變薄，集合管代償性變粗增生，內(nèi)部出現(xiàn)些許纖維化變性。與對照組小鼠（圖5D）相比，5.0 mg/kg NNK 處理組小鼠（圖5B）腎小球出現(xiàn)嚴重變性、萎縮，腎小囊壁層損傷嚴重，腎小體破裂，細胞間質(zhì)分布不均勻，近端小管、遠端小管難以辨認，部分管腔明顯變窄，部分間質(zhì)組織增厚、肥大。

圖5 小鼠腎組織的HE 染色效果圖（400 倍）Fig.5 HE staining images of mouse kidney tissues（400 times）

小鼠睪丸組織切片見圖6。圖6A 是2.5 mg/kg NNK 處理組小鼠睪丸組織，與對照組小鼠（圖6C）相比，生精小管外層生精上皮細胞排列較緊密，緊靠在一起；各級生精小管均有不同程度的萎縮，外壁變薄，甚至一些生精小管內(nèi)部出現(xiàn)空腔，沒有各級精細胞；有精細胞的生精小管出現(xiàn)精子變少的現(xiàn)象。與對照組小鼠（圖6D）相比，而5.0 mg/kg NNK 處理組小鼠（圖6B）部分生精小管緊密排列連接在一起，有些生精小管上皮細胞脫落，且厚度不一；靠近內(nèi)側(cè)的精母細胞與生精上皮細胞分離；組織結(jié)構疏松，內(nèi)側(cè)細胞排列不均勻。

圖6 小鼠睪丸組織的HE 染色效果圖（200 倍）Fig.6 HE staining images of mouse testis tissues（200 times）

有研究表明，NNK 對多種器官組織具有細胞毒性［1］。趙華玲［18］的研究結(jié)果表明，8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）會發(fā)生不良反應，主要是DNA 的氧化損傷所致，對于部分氧化損傷，機體會進行自我修復，從而阻止損傷，但嚴重的氧化損傷會對機體造成傷害，例如造成炎癥等。本研究中通過HE染色證實了NNK 對小鼠的肺、肝、腎和睪丸組織會造成不同程度的傷害，NNK 染毒可使小鼠肺泡隔增生，肝血竇與肝細胞核增大，腎小球出現(xiàn)玻璃樣變性、破碎，睪丸生精小管中各級精細胞明顯減少，進而引發(fā)大量炎癥，這與前人的研究結(jié)果一致。

2.4 NNK 處理對小鼠Prx 家族基因表達的影響

小鼠Prx 基因的相對表達量（圖7）顯示，在NNK 處理后，所有的Prx 基因均被誘導，同一個Prx 基因在不同組織中的表達量不同，且同一組織中處理組小鼠Prx 基因的表達量最高為對照組小鼠的34.8 倍?？梢姡贜NK 脅迫下，小鼠不同組織中Prx 基因的表達出現(xiàn)異常。初步推斷，Prx 基因可調(diào)節(jié)小鼠體內(nèi)ROS 水平，進而在NNK 誘發(fā)腫瘤過程中發(fā)揮預防作用。進一步比較可知：

圖7 小鼠Prx 基因的相對表達量（n=3）Fig.7 Relative expression of Prx gene in mice（n=3）

①與對照組小鼠相比，Prx1 基因在兩種不同劑量NNK 處理組小鼠組織中的表達量基本呈降低趨勢，僅在5.0 mg/kg NNK 處理小鼠腎組織中Prx1 基因的表達量略有升高。同樣，與對照組小鼠相比，Prx3 基因在兩種不同劑量NNK 處理組小鼠組織中的表達量基本呈降低趨勢，僅在5.0 mg/kg NNK 處理組小鼠肺組織中Prx3 基因的表達量略有升高。這說明在NNK 影響下，Prx1 和Prx3基因的表達基本被抑制，可能的原因是Prx1 和Prx3 蛋白對NNK 引起的小鼠組織炎癥不太敏感。②Prx2 基因在不同組織中受NNK 的影響不同，在肺和腎組織中其表達量與對照相比升高，而在肝和睪丸組織中降低，這說明Prx2 蛋白對NNK 導致的不同組織炎癥的敏感程度不同。③與對照組小鼠相比，在處理組小鼠肝和腎組織中Prx4 和Prx6基因受NNK 的影響其表達量升高，而在肺和睪丸組織中其表達量降低。④Prx5 基因在2.5 mg/kg NNK 處理組小鼠組織中其表達量均高于對照組小鼠；對照組小鼠所有組織中Prx5 基因表達量均較低；5.0 mg/kg NNK 處理后，小鼠肺、肝和腎組織中Prx5 基因表達量顯著升高。這說明Prx5 基因可能在NNK 脅迫下發(fā)揮著較重要的抗氧化作用，以抑制腫瘤的發(fā)生。Prx5 是一種多功能蛋白，能夠保護DNA 免受損傷，因而是細胞凋亡的抑制劑。Avila 等［19］的研究表明，Prx5 蛋白是肺上皮細胞的重要抗氧化蛋白之一，其在人肺中的表達量會因炎癥的發(fā)生而增加。在本研究中，與對照組小鼠相比，NNK 誘導的小鼠肺部炎癥中Prx5 基因表達量顯著增加，表明Prx5 可能在肺部感染中起重要作用。Prx5 基因不僅在NNK 處理的小鼠肺組織中高表達，而且在腎臟和睪丸中高表達。由此推斷，Prx5 基因可能是腎臟和睪丸的抗炎效應物之一。

在小鼠肺組織中，與對照組相比，NNK 處理后Prx2 和Prx5 基因表達量升高，而Prx1、Prx4 和Prx6基因表達量降低；在NNK 處理組小鼠肺組織中，上述Prx 基因?qū)?.5 mg/kg NNK 處理的響應較5.0 mg/kg NNK 處理更加敏感；其中，Prx5 基因的最高表達量是對照組處理小鼠的28.4 倍。

在小鼠肝組織中，與對照組相比，NNK 處理后Prx4（在5.0 mg/kg NNK 處理組中）、Prx5 和Prx6（在2.5 mg/kg NNK 處理組中）基因表達量升高，而Prx1、Prx2 和Prx3 基因表達量降低；在小鼠肝組織中，Prx1、Prx2 和Prx3 基因?qū)?.5 mg/kg NNK 處理的反應更加敏感，而Prx4、Prx5 和Prx6 基因?qū)?.0 mg/kg NNK 處理的反應更加敏感；處理組Prx 基因的最高表達量是對照組的34.8 倍。

有研究表明，使用NNK 處理小鼠胎盤后，小鼠肝和肺組織中8-羥基-鳥嘌呤脫氧核苷酸水平升高，這可能是由于NNK 在代謝過程中誘導產(chǎn)生過多的羥基自由基或ROS 所致；當用綠茶、抗氧化劑等NNK 抑制劑處理A/J 小鼠時，除O6-mG 外的DNA 加合物的含量降低［20］。而Prx 蛋白最為顯著的功能是清除過氧化物，同時氧化應激可以誘導Prx 的表達，這表明Prx 與ROS 的生成相關［13］。本研究結(jié)果也表明在NNK 處理下Prx 基因表達量發(fā)生異常，提示Prx 基因可能在NNK 導致組織損傷的過程中發(fā)揮一定的作用，極有可能與NNK 誘導下的ROS 生成有關，這就為后續(xù)Prx 基因在NNK處理下的功能研究提供了參考。

在小鼠腎組織中，與對照組相比，NNK 處理后Prx5 基因表達量升高，其他Prx 基因表達量降低；Prx1、Prx2 和Prx4 基因表達量比Prx3、Prx5 和Prx6基因低；NNK 處理組小鼠腎組織中Prx 基因的最高表達量是對照組的26.4 倍。同樣，在小鼠睪丸組織中，與對照組相比，NNK 處理后Prx5 基因表達量升高，其他Prx 基因表達量降低；NNK 處理組小鼠睪丸組織中Prx 基因的最高表達量是對照組的7.0 倍。

結(jié)合本實驗室及國內(nèi)外其他學者的研究結(jié)果推測，在NNK 作用后，小鼠器官組織中的ROS 升高，ROS 會攻擊細胞中DNA 的脫氧鳥苷，使8-羥基鳥嘌呤脫氧核苷酸水平升高，進而促進腫瘤的發(fā)生，而在這一過程中，Prx 基因可以通過調(diào)節(jié)其表達量，進一步清除多余的ROS，從而使機體保持氧化還原的平衡狀態(tài)。

3 結(jié)論

對小鼠進行了NNK 腹腔注射，并利用HE 染色和qRT-PCR 技術評價了NNK 對小鼠的毒性和Prx 基因表達的影響。與對照組小鼠相比，NNK 處理組小鼠好斗性增強，進食量無較大變化，但在染毒5 周后，小鼠體質(zhì)量有所降低。HE 染色結(jié)果表明，處理組小鼠肺組織肺泡隔增生，肝組織肝血竇與肝細胞核增大，腎小球出現(xiàn)玻璃樣變性、破碎，睪丸生精小管中各級精細胞明顯減少。在NNK處理后，所有Prx 基因均被誘導，同一Prx 基因在不同組織中的表達量不同，且在肝組織中處理組小鼠Prx 基因的表達量最高，為對照組的34.8 倍。在NNK 脅迫下，Prx 基因的表達發(fā)生異常，結(jié)果提示Prx 基因可能在NNK 導致組織損傷的過程中發(fā)揮一定的作用，這就為后續(xù)Prx 基因在NNK 處理下的功能研究奠定了基礎，并且不同Prx 基因的功能還可能是互補的。對照組小鼠所有組織中Prx5基因的表達量均較低，而在NNK 處理后其表達量有所升高，在5.0 mg/kg NNK 處理后，其表達量升高較明顯，這表明Prx5 基因在NNK 脅迫下可能發(fā)揮更重要的作用，對下一步研究Prx5 在NNK 導致組織損傷的過程中可能發(fā)揮的功能和作用機制提供了理論依據(jù)。