趙天野
(吉林省農(nóng)安縣萬(wàn)順鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站,吉林農(nóng)安 130200)
番石榴(Psidium Guajave)屬于桃金娘科植物,為綠色灌木或者小喬木,俗稱為雞屎果,主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)。我國(guó)南方以云南、廣西、四川、海南等地分布最為廣泛[1]。番石榴含有大量的槲皮素等黃酮類物質(zhì)、揮發(fā)油、鞣質(zhì)、齊墩果酸、熊果酸綠原酸、咖啡酸、山柰酚、鐵烏立克酸和山柰酚苷[2]。有報(bào)道稱番石榴葉精油中所含有的揮發(fā)性成分有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗菌等功能[3]?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn),番石榴葉對(duì)于抵御病毒、延緩氧化、抵抗細(xì)菌、降低人體血糖有一定作用[4]。番石榴葉還具有令人愉悅、消除炎癥、止血、解決口渴、驅(qū)散蚊蟲(chóng)和止癢止瀉等藥理作用[5]。本試驗(yàn)主要對(duì)番石榴果、葉的抑菌效果進(jìn)行比較研究。
1.1.1 藥材
番石榴果實(shí)和葉,購(gòu)自吉林省長(zhǎng)春市農(nóng)安縣國(guó)醫(yī)大藥房,產(chǎn)地四川。
1.1.2 培養(yǎng)基
蛋白胨,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;牛肉浸粉,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;酵母浸粉,河南森漢生物科技有限責(zé)任公司;瓊脂粉,天津市光復(fù)細(xì)化工研究所;胰化蛋白胨,天津市光復(fù)細(xì)化工研究所;氫氧化鈉,滄州云港化工有限公司;氯化鈉,東莞市喬科化學(xué)有限公司;蒸餾水。
1.1.3 實(shí)驗(yàn)菌種
大腸桿菌菌種、金黃色葡萄球菌菌種,農(nóng)安縣動(dòng)物疫病防控中心。
DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱,江蘇天翎;DDHZ-300空氣式恒溫振蕩器,上海和恒;DZKW-S-4數(shù)顯恒溫水浴鍋,上海一凱;BBS-DDC-A超凈工作臺(tái),蘇州三星凈化;YX600W壓力蒸汽滅菌消毒鍋,上海三伸;DL-1電子萬(wàn)用爐,富興電子;LG-08A萬(wàn)能高速搖擺粉碎機(jī),上海新諾儀器;DHG-9240A臺(tái)式恒溫電熱鼓風(fēng)干燥箱,上海儀器儀表廠;FA1204B電子天平,上海天美天平儀器;打孔器等。
1.3.1 煎煮法提取番石榴果、葉
用粉碎機(jī)將番石榴果實(shí)和葉粉碎,各取40 g置于500 mL燒杯中,加入400 mL蒸餾水,于55 ℃水浴中加熱2 h后用紗布過(guò)濾,殘?jiān)性俜謩e加入100 mL蒸餾水置于55 ℃水浴中加熱1 h,再次過(guò)濾,合并濾液,分別得到果實(shí)和葉水提取液,并濃縮至20 mL,得到提取原液,放于冰箱備用[6]。
1.3.2 藥敏片的制備
用打孔器將濾紙片打成直經(jīng)為6 mm的小圓片若干,放入燒杯中并用多層報(bào)紙將瓶口包扎緊密。160 ℃條件下干熱滅菌1.5 h,在60 ℃條件下烘干備用。取上述濃縮后的提取液稀釋2倍、4倍、8倍成1.00、0.50、0.25 g/mL,各取4種濃度的提取液2 mL置于平皿中,把制備好的濾紙片在各濃度提取液中浸泡8 h,之后取出放置在培養(yǎng)皿中,在恒溫箱37 ℃條件下烘干24 h,并做好標(biāo)記,置于冰箱中保存?zhèn)溆肹7]。
1.3.3 大腸桿菌的接種培養(yǎng)
(1)制備LB液體培養(yǎng)基:稱取胰化蛋白胨10.0 g、酵母浸粉5.0 g、NaCl 110.0 g于1 L的大燒杯中,加入800 mL蒸餾水,用4 mol/L NaOH和0.1% HCl調(diào)節(jié)pH為7.0,加水定容至1 000 mL,放于高溫蒸汽滅菌鍋中設(shè)置溫度121 ℃,滅菌20 min,于4 ℃保存?zhèn)溆肹8]。
(2)接種培養(yǎng):將大腸桿菌菌種用接種環(huán)在酒精燈旁接種于LB液體培養(yǎng)基中,在溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速160 r/min條件下進(jìn)行培養(yǎng)12 h[9],濃度約為5×107cfu/mL的菌量。
1.3.4 金黃色葡萄球菌的接種培養(yǎng)
(1)培養(yǎng)基制備:取15 g瓊脂置于1 000 mL燒杯中,加入蒸餾水至1 000 mL并加熱煮沸至瓊脂完全溶解,將5 g蛋白胨加入瓊脂中,并用玻璃棒攪拌至完全溶解,再加入1 g牛肉浸粉和2 g酵母浸粉,攪拌至完全溶解,用10%的NaOH調(diào)pH值至7~8,分裝,經(jīng)121 ℃高壓滅菌 15 min[10],備用。
(2)接種培養(yǎng):在無(wú)菌操作臺(tái)上,在培養(yǎng)皿底部做好記號(hào)后,用接種槍取大腸桿菌培養(yǎng)液1 mL,涂于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿上,將三角架涂菌器旋轉(zhuǎn)一周,使菌液均勻分布在培養(yǎng)皿上。用同樣的方法取金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液,涂于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上[11]。
1.3.5 貼藥敏片
用鑷子將不同濃度果實(shí)和葉的藥敏片放置在已接種細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿表面的4個(gè)區(qū)域,在4 ℃條件下預(yù)擴(kuò)散4 h,于37 ℃下培養(yǎng)4 h[12]。
1.3.6 測(cè)量抑菌圈大小
取出培養(yǎng)皿,用游標(biāo)卡尺在抑菌圈的不同方向測(cè)量2次,得到2組數(shù)據(jù),計(jì)算平均值得抑菌圈直徑(D)。抑菌效果的判定標(biāo)準(zhǔn):D>19 mm為高度敏感;13 mm<D≤19 mm為中度敏感;8 mm<D≤13 mm為低度敏感;D<8 mm為不敏感[13]。
由表1可以看出,番石榴葉的水提液及其2倍稀釋液對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為16.03 mm、14.06 mm,對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為15.04 mm、13.28 mm,表示番石榴葉提取液有比較強(qiáng)的抑菌效果,4倍液葉對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別是12.10 mm、9.06 mm,表明抑菌效果較弱。而番石榴果實(shí)的提取液對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌抑菌圈分別為12.54 mm、12.02 mm,表明抑菌效果較弱,其余濃度時(shí)抑菌圈直徑都小于8 mm,表明幾乎沒(méi)有抑菌效果。
表1 番石榴果實(shí)和葉水提液的抑菌圈直徑
由表2可以看出,大腸桿菌及金黃色葡萄球菌對(duì)番石榴果實(shí)提取原液為低強(qiáng)度敏感;對(duì)2倍液不敏感,即耐藥;4倍液和8倍液沒(méi)有抑菌效果。大腸桿菌及金黃色葡萄球菌對(duì)番石榴葉提取原液和2倍液為中度敏感,對(duì)4倍液為低度敏感,而8倍液沒(méi)有抑菌效果。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析,番石榴葉的水提液抑菌效果更明顯,濃度越高抑菌效果越好。
表2 番石榴果實(shí)和葉水提物對(duì)細(xì)菌的敏感度
黃艷等[14]采取不同溶劑對(duì)番石榴葉進(jìn)行提取,不同提取物對(duì)豬大腸桿菌的抑菌效果差異不明顯,石油醚提取物對(duì)豬金黃色葡萄球菌的抑菌效果較好(0.195 mg/mL)。周濃等[15]采用超聲波輔助技術(shù)提取番石榴果實(shí)中多酚,并測(cè)其抑菌活性,結(jié)果顯示,番石榴多酚對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌具有抑制作用,最低抑菌濃度(MIC)分別為3.00 mg/mL、1.50 mg/mL、1.50 mg/mL。
番石榴葉水提取液有較好的抑菌作用,水提取液的濃度越高,抑菌效果越顯著;且在相同濃度條件下,葉水提取液的抑菌效果較強(qiáng)于果實(shí)水提液。對(duì)番石榴葉和果實(shí)水提取液進(jìn)行的體外抑菌效果研究中,存在一些欠缺,如受試菌較少,今后將擴(kuò)大抑菌菌種的范圍,同時(shí)要進(jìn)一步對(duì)其化學(xué)成分和影響因素進(jìn)行研究,為新藥開(kāi)發(fā)與鑒定提供依據(jù)。