李麗蓉，顏干明，胡越，肖拯

（1.江西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，江西南昌 330052；2.江西古漢精制中藥飲片有限公司，江西南昌 330000）

枳殼為蕓香科柑橘屬植物酸橙及其栽培品系的干燥未成熟果實(shí)，枳殼是江西省的道地藥材，但在湖南、四川、浙江、山西和貴州等地均有栽培。枳殼含有黃酮類、生物堿類、揮發(fā)油類以及香豆素類等有效成分，具有理氣寬中、行滯消脹的功效[1-2]。目前，有部分枳殼指紋圖譜的相關(guān)研究報(bào)導(dǎo)[3-9]，但通過指紋圖譜技術(shù)進(jìn)行江枳殼（江西產(chǎn)區(qū)的枳殼）與非道地藥材鑒別尚無明確參考依據(jù)。本文將不同產(chǎn)地枳殼藥材進(jìn)行HPLC指紋圖譜表征和比較，運(yùn)用聚類分析和指紋圖譜軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，旨在為枳殼的道地性鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-20高效液相色譜儀，島津儀器（蘇州）有限公司；UV756紫外分光光度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司；AUW120D十萬分之一電子天平，島津儀器（蘇州）有限公司；HC-150T2型高速多功能粉碎機(jī)，永康市綠可食品機(jī)械有限公司；FST-JY普利菲爾超純水機(jī)，濟(jì)南佰源醫(yī)療設(shè)備有限公司；KQ3200B超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

柚皮苷對(duì)照品，批號(hào)110831-201204，浙江永健醫(yī)藥有限公司，純度≥90%；新橙皮苷，批號(hào)23094-69-1，浙江永健醫(yī)藥有限公司，純度≥98%；川陳皮素，批號(hào)476-66-4，浙江永健醫(yī)藥有限公司，純度≥98%；橘皮素，批號(hào)476-66-4，浙江永健醫(yī)藥有限公司，純度≥98%；甲醇，色譜純，天津市永大化學(xué)試劑廠；磷酸，分析純，上海笛柏化學(xué)試劑廠；水為超純水。

1.2 試驗(yàn)藥材

采集16個(gè)產(chǎn)地的枳殼藥材樣品，藥材信息如表1所示。經(jīng)江西古漢精制中藥飲片有限公司顏干明執(zhí)業(yè)中藥師鑒定，所有樣品均為蕓香科植物酸橙及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí)。

表1 不同產(chǎn)地枳殼藥材樣品信息

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 供試品溶液的制備

取各枳殼藥材粉末0.2 g，加入甲醇溶液30 mL，超聲提取30 min，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，即得供試品溶液。

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備

分別取柚皮苷、新陳皮苷、川陳皮素和橘皮素對(duì)照品2.31 mg、2.32 mg、0.92 mg和0.96 mg，用甲醇溶解于10 mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，即得對(duì)照品溶液。

1.3.3 色譜條件

采用Eclipse Plus-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）進(jìn)行檢測(cè)，流動(dòng)相為甲醇（A）和pH為4.5的磷酸水溶液（B），柱溫30 ℃，檢測(cè)波長320 nm。洗脫程序?yàn)椋?～20 min，30%～50%（A）；20～35 min，50%～70%（A）；35～50 min，70%～80%（A）；50～60 min，80%～100%（A）。改變檢測(cè)波長和流動(dòng)相，比較不同條件下的出峰情況，優(yōu)選出最佳色譜條件。

1.3.4 枳殼藥材指紋圖譜的采集

按“1.3.1”項(xiàng)下方法制備各供試品溶液，在“1.3.3”選定的色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄色譜圖并積分，同時(shí)標(biāo)定了8個(gè)共有峰。通過LC solution輸出藥材的色譜圖。

1.4 方法學(xué)考察

1.4.1 精密度試驗(yàn)

按“1.3.1”項(xiàng)下方法制備同一枳殼供試品溶液，在“1.3.3”的選定色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，選擇保留時(shí)間18.789 min的色譜峰為參照峰，計(jì)算得到HPLC色譜圖中所有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%。

1.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“1.3.1”項(xiàng)下方法制備同一枳殼供試品溶液，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、12 h和24 h測(cè)定，選擇保留時(shí)間18.789 min的色譜峰為參照峰，計(jì)算相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均小于3%，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱定6份枳殼藥材0.2 g，按“1.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液進(jìn)樣分析，選擇保留時(shí)間18.789 min的色譜峰為參照峰，計(jì)算各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)保留峰面積的RSD值均小于3%。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件

基于文獻(xiàn)研究[6-9]比較了254 nm、283 nm、300 nm、320 nm、330 nm 5個(gè)波長，結(jié)果顯示，320 nm波長下色譜峰的數(shù)量較多，分離度較好，故選擇320 nm作為枳殼檢測(cè)波長；分別考察了甲醇-水，甲醇-磷酸水，乙腈-水，乙腈-磷酸水體系，根據(jù)色譜圖發(fā)現(xiàn)，用甲醇-水和乙腈-水體系時(shí)色譜圖拖尾較嚴(yán)重，故考慮甲醇-磷酸水和乙腈-磷酸水體系，乙腈-磷酸水體系和甲醇-磷酸水體系峰型相似，考慮經(jīng)濟(jì)性，故選擇甲醇-磷酸水體系。通過對(duì)甲醇-磷酸水pH值比較峰型及結(jié)合柱子的適應(yīng)性，最終選用甲醇-磷酸水（pH=4.5）體系為流動(dòng)相。

2.2 枳殼藥材的指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)

運(yùn)用國家藥典委員會(huì)制定的《中國色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》分析數(shù)據(jù)并對(duì)相關(guān)參數(shù)進(jìn)行自動(dòng)匹配，結(jié)合對(duì)照指紋圖譜（圖1），計(jì)算各產(chǎn)地枳殼藥材提取物指紋圖譜的相似度。不同產(chǎn)地指紋圖譜疊加圖見圖2。如表2所示，為16批枳殼指紋圖譜相似度結(jié)果。浙、川和江西產(chǎn)地指紋圖譜相似度均大于0.85，表明各產(chǎn)地藥材之間具有較好的一致性，而16批次枳殼相似度計(jì)算顯示相似度較差，其中S13（采集地點(diǎn)為越南一帶）相似度最低。

圖1 枳殼對(duì)照指紋圖譜

2.3 聚類分析

利用SPSS 19.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，因S13～S16 4個(gè)產(chǎn)區(qū)枳殼指紋圖譜與其他12個(gè)產(chǎn)區(qū)的指紋圖譜差異較大，故進(jìn)行剔除處理。將浙、川和江西產(chǎn)地枳殼藥材特征峰的相對(duì)峰面積標(biāo)準(zhǔn)化后采用組間聯(lián)接法，利用歐式距離度量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)樣品進(jìn)行聚類，結(jié)果見圖3。枳殼藥材可大致分為3大類，其中S4、S5聚為一類，S6、S7、S8、S10聚為一類，S1、S2、S3、S9、S11和S12聚為一類。聚類分析顯示產(chǎn)地及采集時(shí)間會(huì)影響枳殼藥材的質(zhì)量。

圖2 16批枳殼高效液相指紋圖譜

表2 16批枳殼指紋圖譜相似度結(jié)果表

圖3 不同產(chǎn)地枳殼聚類圖

3 結(jié)論

從中藥指紋圖譜的角度分析16批枳殼，發(fā)現(xiàn)10批江西枳殼的指紋圖譜相似度極高，浙、川枳殼與江西枳殼指紋圖譜相識(shí)度較高，但越南一帶、湖南省益陽市、陜西省漢中市及皖南一帶與江西枳殼指紋圖譜存在較大差異，說明地域?qū)﹁讱に幉牡馁|(zhì)量影響較大，其中以3號(hào)峰峰面積差異最大，后續(xù)將繼續(xù)收集其他產(chǎn)地藥材，以期為枳殼更好的開發(fā)利用提供資料。