孫慧東，張甘良，張江禎

（1.復(fù)旦大學(xué)，上海200433；2.上海津曼特生物科技有限公司，上海201203）

單克隆抗體藥物為多結(jié)構(gòu)域大分子蛋白，與傳統(tǒng)小分子藥物相比，在儲存過程中容易發(fā)生聚集、降解等不穩(wěn)定現(xiàn)象，造成藥品批間差異增大及免疫原性改變等不良后果[1]。為了保證藥品的長期有效，并滿足監(jiān)管的要求，一般在制劑處方中加入穩(wěn)定劑，增強單克隆抗體穩(wěn)定性，確保產(chǎn)品的有效性和安全性。穩(wěn)定劑一般包括表面活性劑和有機助溶劑。表面活性劑具有防止界面蛋白吸附、蛋白質(zhì)變性和蛋白質(zhì)聚集的保護作用，可以降低凍融、混合、過濾、凍干、運輸和儲存等過程中蛋白的聚集，防止蛋白被吸附到容器表面，對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定起到關(guān)鍵作用，已成為穩(wěn)定蛋白藥物配方中不可或缺的部分[2]。

藥物制劑中常見的表面活性劑是聚山梨酯20（Polysorbate 20，PS 20）和聚山梨酯80（Polysorbate 80，PS 80），在生物制劑中廣泛應(yīng)用，但同時也面臨許多挑戰(zhàn)。目前，市售的聚山梨酯20或聚山梨酯80都是不同脂肪酸酯的混合物，可能導(dǎo)致批次之間的顯著差異[3]，且在放置過程中，不可避免地發(fā)生不同程度的降解，產(chǎn)生各種降解產(chǎn)物，包括過氧化物、甲酸、乙酸、反應(yīng)性醛/酮和游離脂肪酸[4]。隨著時間的推移，游離脂肪酸的積累會導(dǎo)致蛋白藥物產(chǎn)品中形成可見異物和不溶性微粒[5]，可能存在風險。

聚山梨酯化學(xué)不穩(wěn)定的機制已經(jīng)被廣泛研究，自氧化、脂肪酯鍵的水解以及環(huán)氧乙烷亞基的裂解都會導(dǎo)致這種不穩(wěn)定性[6-8]。這種化學(xué)不穩(wěn)定性降低了制劑中聚山梨酯的含量，并有可能在凍融、制造、運輸和儲存過程中影響蛋白質(zhì)藥物的質(zhì)量。另外，降解產(chǎn)物對蛋白質(zhì)的影響也需要進一步研究。Kishore等[9]在藥物相關(guān)條件下對安慰劑和蛋白質(zhì)制劑進行的一系列研究中觀察到過氧化物的積累，并得出結(jié)論認為自氧化是主要機制。在這項研究中，還研究了隨時間推移可能形成的各種聚山梨酯降解物對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，盡管存在聚山梨酯降解物，但聚山梨酯閾值水平的存在對于維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性很重要。Labrenz[10]報道，包含聚山梨酯80的多種單抗產(chǎn)品在儲存過程中觀察到可見顆粒物。這些顆粒是由聚山梨酯80水解產(chǎn)生的游離脂肪酸，并且制劑產(chǎn)品中的聚山梨酯80含量也隨之下降。殘留宿主細胞蛋白中的一種磷脂酶B2被認為是聚山梨酯80水解的根本原因[10]。Anthony Tomlinson等[11]報道有2種單抗成品在2～8 ℃長期儲存后，輔料中的聚山梨酯20發(fā)生降解，生成的游離脂肪酸經(jīng)長期累積后形成白色顆粒沉淀。Dixit等[12]也報道了在一種硫酸酯酶藥物產(chǎn)品在2～8 ℃長期儲存后，輔料中的聚山梨酯20發(fā)生降解形成游離脂肪酸顆粒，磷脂酶B2同樣被認為是造成聚山梨酯20發(fā)生降解的根本原因。

上海津曼特生物科技有限公司在抗EGFR（Epidermal growth factor receptor，一種表皮生長因子受體）單克隆抗體藥物制劑的早期開發(fā)工作中，發(fā)現(xiàn)其在（5±3）℃長期儲存后，產(chǎn)品中的聚山梨酯20會發(fā)生降解，游離脂肪酸經(jīng)長期積累形成白色顆粒，將樣品放置于室溫后，這些顆粒仍然可見，且搖晃后顆粒不消失。本文對此現(xiàn)象進行調(diào)查，以探討聚山梨酯20發(fā)生降解的根本原因。通過疏水“流穿”模式層析，去除產(chǎn)品中可能導(dǎo)致聚山梨酯20降解的殘留宿主細胞雜質(zhì)磷脂酶B2，并進行加速穩(wěn)定性實驗，于25 ℃儲存6個月后，考察可見異物和不溶性微粒情況。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

抗EGFR單克隆抗體為津曼特公司生產(chǎn)，醋酸鈉、冰醋酸、乙醇、氫氧化鈉等化學(xué)試劑均為藥用級，供應(yīng)商為湖南爾康；Hamster PLBL2 ELISA KIT試劑盒購自ICL（Immunology Consultants Laboratory）；填料為GE Healthcare的Captophenyl（high sub）；所用設(shè)備為GE Healthcare的液相層析系統(tǒng)AKTA purifier，Tricron 5/100層析柱；貝克曼的液體顆粒計數(shù)系統(tǒng)HIAC9703。

1.2 實驗方法

1.2.1 磷脂酶B2含量檢測

將Hamster PLBL2 ELISA KIT中的磷脂酶B2標準品用超純水溶解后，梯度稀釋，得到磷脂酶B2梯度系列標準品，濃度依次為20.00 ng/mL、10.00 ng/mL、5.00 ng/mL、2.50 ng/mL、1.25 ng/mL、0.63 ng/mL和0.31 ng/mL，將單抗藥物制劑樣品經(jīng)過適當倍數(shù)的稀釋后，與標準品及空白對照加樣到酶標板條上，孵育，后經(jīng)過洗板、加一抗、加二抗、顯色等步聚，在酶標儀上讀取OD450值，根據(jù)標準品的濃度和OD450值通過四參數(shù)邏輯擬合法擬合標準曲線。如圖1所示，擬合得到四參數(shù)的數(shù)值分別為A=0.063、B=1.288、C=2.474、D=3.267。

圖1 磷脂酶B2含量與OD450標準曲線與方程

1.2.2 疏水層析

將 Captophenyl（HS）填料裝入 Tricon 5/100層析柱，柱體積2 mL，按表1參數(shù)進行層析實驗，上樣載量100 mg/mL，收集流穿樣品。

表1 疏水層析參數(shù)

1.2.3 穩(wěn)定性研究

將疏水層析前后的樣品灌裝成制劑進行穩(wěn)定性加速實驗考察，（25±2）℃考察6個月，分別于0個月、1個月、3個月、6個月取樣，考察可見異物及不溶性微粒。

2 結(jié)果與分析

2.1 疏水層析實驗

采用疏水層析流穿模式純化蛋白，即使目的蛋白流穿，疏水性強的雜質(zhì)結(jié)合在層析柱上。在低鹽條件下上樣，收集目的蛋白流穿液，檢測流穿收集液的磷脂酶B2含量，磷脂酶B2濃度由上樣前的17.3 mg/L降低至0.1 mg/L以下，疏水層析去除磷脂酶B2效果良好。

2.2 去除磷脂酶B2樣品的穩(wěn)定性研究實驗

疏水層析前后，對樣品進行穩(wěn)定性考察，結(jié)果如表2所示。去除磷脂酶B2后，樣品中未出現(xiàn)可見異物，不溶性微粒也未出現(xiàn)明顯增加，制劑穩(wěn)定性得到明顯改善。導(dǎo)致聚山梨酯20降解的根本原因是蛋白產(chǎn)品中存在的痕量雜質(zhì)磷脂酶B2，磷脂酶B2蛋白是藥物中的殘留宿主細胞蛋白雜質(zhì)，隨目的蛋白一起被共純化，具有水解酶活性，已被證實可以降解藥物產(chǎn)品中的聚山梨酯20，從而導(dǎo)致長期儲存過程中形成不溶性微粒等可見異物。

表2 疏水層析前后樣品（25±2）℃穩(wěn)定性研究結(jié)果

3 結(jié)論

磷脂酶B2是一類脂酶，具有較強的疏水性，通過疏水“流穿”模式層析，去除了磷脂酶B2雜質(zhì),并在隨后的穩(wěn)定性研究中證實去除磷脂酶B2可有效抑制聚山梨酯20的降解，避免單克隆抗體產(chǎn)品中形成不溶性微粒和可見異物，為單抗產(chǎn)品商業(yè)化開發(fā)的下游工藝及制劑配方篩選等方面的研究提供了思路與方法。