嚴朗，侍雯婧，田逸君，張吉芊竹，陳基快

（中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)海軍醫(yī)學(xué)系衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，上海 200433）

小鼠是目前最為常用的實驗動物，其中的免疫缺陷小鼠，如BALB/c裸鼠和重癥聯(lián)合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency，SCID）小鼠廣泛應(yīng)用于人類腫瘤研究中[1]。BALB/c裸鼠是先天性胸腺缺陷的突變小鼠，由于第Ⅷ連鎖群內(nèi)裸體位點基因發(fā)生純合而形成，其特點是T細胞免疫功能缺陷，無接觸敏感性和移植排斥反應(yīng)，廣泛用于免疫學(xué)、腫瘤學(xué)和疾病發(fā)生機理的研究[2]。已有不少研究表明BALB/c裸鼠T細胞明顯減少或缺失，B淋巴細胞正常，但功能欠正常，免疫球蛋白主要是IgM，只含少量IgG[3]。然而BALB/c裸鼠的巨噬細胞吞噬功能尚不明確。

巨噬細胞是參與體內(nèi)組織防御的一群重要的免疫細胞，一方面可以利用吞噬作用來清除外來病原體和自身細胞碎片，另一方面可以激發(fā)獲得性免疫反應(yīng)[4]。傳統(tǒng)觀點認為，巨噬細胞作為機體固有免疫細胞，具有抑制腫瘤生長的作用。但是最近研究表明，參與構(gòu)成腫瘤微環(huán)境的巨噬細胞（Tumor-associated macrophage，TAM）具有促進腫瘤生長、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥等作用[5]。BALB/c裸鼠作為腫瘤研究的重要工具鼠，明確其巨噬細胞的功能對于腫瘤發(fā)生發(fā)展、干預(yù)與預(yù)防研究至關(guān)重要。

本研究通過比較BALB/c裸鼠及野生型BALB/c小鼠兩種不同品系的小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能，探討兩種不同小鼠巨噬細胞的功能，為后續(xù)裸鼠荷瘤實驗結(jié)果分析提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

雄性6周齡SPF級BALB/c裸鼠和BALB/c小鼠各6只，體重18～20 g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司[SCXK（滬）2017-0005]，飼養(yǎng)于海軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心SPF動物房[SYXK（滬）2017-0004]。所有小鼠飼養(yǎng)于12 h/12 h光照/黑暗條件下，自由采食和飲水，所有操作均符合海軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物倫理學(xué)要求（審批號：20180056）。

1.2 試劑與儀器

牛血清白蛋白BSA（上海生工生物有限公司，B600036-0250），RPMI1640培養(yǎng)基（Hyclone，SH30256.01），胎牛血清（Gibco，10099-141），磷酸緩沖液PBS（Hyclone，SH30256.01），青霉素、鏈霉素（Gibco，15140-122），巰基乙醇酸鈉（Merck，1.08191.0500）；FITC RAT IgG2a，Ctrl（400505），F(xiàn)ITC F4/80（123107），? Red ；熒光倒置顯微鏡（日本OLYMPUS，IX71），流式細胞儀（美國Beckman，CytoFLEX），小動物麻醉機（上海玉研科學(xué)儀器有限公司，ABS型），多功能酶標儀（美國Molecular Devices，SpectraMaxM2e）。

1.3 試驗方法

1.3.1 小鼠腹腔巨噬細胞提取和培養(yǎng)

在實驗前3天每天腹腔注射3%巰基乙醇酸鈉（2 mL/只），用異氟烷麻醉小鼠，頸椎脫臼法處死小鼠，75%酒精浸泡1～2 min后在超凈臺中暴露出腹膜，用移液器吸5 mL無菌PBS液注入腹腔中，同時從兩側(cè)用手指揉壓腹膜壁，吸取腹腔中液體入離心管內(nèi)，4℃、1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，重復(fù)2次，加入完全培養(yǎng)液（90% RPMI1640培養(yǎng)基+10%FBS+1%雙抗）重懸。調(diào)整濃度至2×105個/mL，接種到6孔板中，每孔2 mL。5% CO2溫箱孵育4 h后，換液，并用RPMI1640培養(yǎng)基洗1～2次，棄去未貼壁細胞，貼壁細胞為單層的巨噬細胞。

1.3.2 巨噬細胞流式細胞術(shù)鑒定

吸掉培養(yǎng)基，PBS洗1次，利用細胞刮收集巨噬細胞，吹打均勻后將細胞懸液分為兩管，1號管為陰性對照，1∶300加入FITC RAT IgG2a,κisotype Ctrl，2號1∶300加入FITC anti-mouse F4/80抗體，避光、常溫標記30 min，然后用流式緩沖液洗2遍，再用1 mL流式緩沖液重懸并移入流式管中，進行流式細胞術(shù)鑒定。

1.3.3 巨噬細胞吞噬熒光微球能力檢測

取熒光微球與1%BSA以1∶100體積比混勻，濃度為5×106個/mL，37 ℃避光孵育30 min，超聲處理5 min，臨用前配。6孔板每個孔加入2 mL熒光微球，即1×107個/孔，96孔板每個孔加入100 μL，放入CO2培養(yǎng)箱中避光孵育1 h，棄上清，利用PBS緩沖液輕輕洗滌2次，最后加入1 mL PBS。利用熒光顯微鏡拍照，96孔板用多功能酶標儀在500和585 nm波段下讀取熒光數(shù)值。同時，利用細胞刮收集細胞于上流式細胞儀檢測。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 23軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以平均值±標準差表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 細胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

獲取的小鼠腹腔細胞在含RPIM1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后，細胞在顯微鏡下觀察圖像如圖1所示。兩種小鼠來源腹腔巨噬細胞形態(tài)不均一，可呈棱形、短桿狀或橢圓形等，有偽足和突起，界限清楚，有鈍圓形突起。兩組間細胞密度肉眼未見明顯差異。

圖1 培養(yǎng)24 h后的腹腔巨噬細胞形態(tài)

2.2 腹腔巨噬細胞流式細胞術(shù)鑒定

流式細胞儀檢測結(jié)果如圖2所示，BALB/c小鼠腹腔巨噬細胞中F4/80陽性細胞比例為65.7%，表明該方法可以獲得合適純度的巨噬細胞。

圖2 BALB/c小鼠腹腔巨噬細胞F4/80陽性細胞純度流式檢測結(jié)果峰圖

2.3 巨噬細胞吞噬熒光微球?qū)嶒?/h3>

利用熒光顯微鏡拍照可見紅色熒光點為巨噬細胞吞噬的熒光微球，圖3A可見BALB/c小鼠腹腔巨噬細胞大量吞噬熒光微球，而BALB/c裸鼠來源巨噬細胞吞噬熒光微球顯著減少。圖3B為多功能酶標儀檢測讀數(shù)結(jié)果，同樣顯示BALB/c小鼠腹腔巨噬細胞熒光讀數(shù)顯著大于BALB/c裸鼠來源巨噬細胞（P＜0.05），有顯著性差異。

用流式細胞術(shù)法比較兩種小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能，結(jié)果如圖4所示，可見BALB/c小鼠腹腔巨噬細胞平均熒光讀數(shù)顯著大于BALB/c裸鼠來源巨噬細胞，結(jié)果有顯著性差異（P＜0.05）。

BALB/c裸鼠為BALB/c帶nu基因的同源近交系。裸基因是八號染色體上的隱性突變基因。病原體進入宿主體內(nèi)首先啟動固有免疫應(yīng)答，巨噬細胞作為主要的固有免疫細胞，其吞噬作用在抗感染、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要的作用[6]。研究表明，BALB/c裸鼠容易患病毒性肝炎和肺炎，提示BALB/c裸鼠巨噬細胞吞噬功能障礙[7]。因此對BALB/c裸鼠巨噬細胞的吞噬功能進行深入研究十分必要。

圖3 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬熒光微球功能檢測

圖4 流式細胞術(shù)檢測小鼠腹腔巨噬細胞吞噬熒光微球功能

巨噬細胞是具有多種功能的免疫細胞，其不僅在先天免疫中發(fā)揮重要作用，也是機體細胞免疫中的一類關(guān)鍵細胞。目前，體外培養(yǎng)巨噬細胞來源很多，包括骨髓巨噬細胞、外周血巨噬細胞、腹腔巨噬細胞和肺臟巨噬細胞等，分離方法也有貼壁法、免疫磁珠分選法等[8-9]。本研究選取預(yù)先腹腔注射巨噬細胞刺激劑后腹腔灌洗提取腹腔巨噬細胞。該方法簡單高效，提取巨噬細胞可滿足蛋白檢測、功能檢測等多種分析方法。F4/80是檢測巨噬細胞的常用膜表面標志，即表皮生長因子樣激素受體1，主要表達于骨髓來源的單核細胞和巨噬細胞，盡管其在一些內(nèi)皮樣細胞和嗜酸性粒細胞中也有表達，但是目前F4/80是小鼠巨噬細胞公認的標志物。本實驗提取的巨噬細胞比例為65%左右，和文獻報道一致[10]。

巨噬細胞的吞噬作用是先天免疫中最基本的防御機制，與細胞胞吞作用密切相關(guān)。吞噬作用包括識別胞吞物、攝入和清除等復(fù)雜過程，與其表面存在的多種受體有關(guān)。之前研究對無胸腺小鼠的腹腔巨噬細胞吞噬功能存在爭議。Vetvicka[11]等發(fā)現(xiàn)無胸腺小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能代償性增加，可能與巨噬細胞表面FcR和補體受體增加有關(guān)。但是Ramos-Zepeda等[12]發(fā)現(xiàn)無胸腺小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能與野生型相比并無變化。這可能與無胸腺小鼠的種系不同以及吞噬功能的檢測方法不同有關(guān)。此次研究發(fā)現(xiàn)BALB/c裸鼠吞噬熒光微球功能下降，并運用熒光顯微鏡、多功能酶標儀和流式細胞儀多種方法驗證。另外，巨噬細胞提取過程的區(qū)別也可能是結(jié)果不一致的原因。

3 結(jié)論

裸鼠和野生型小鼠作為動物模型廣泛應(yīng)用于各種實驗中，比較兩種小鼠巨噬細胞吞噬作用有利于實驗動物模型的建立與創(chuàng)新，促進動物實驗向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化。本次研究結(jié)果表明，BALB/c裸鼠的腹腔巨噬細胞吞噬功能較BALB/c小鼠減弱，但是究竟那些基因改變影響裸鼠巨噬細胞吞噬功能還不明確，需要進一步的探索與研究。