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        高效液相色譜法測定不同品系亳白芍中4種化學(xué)成分含量

        2020-08-27 06:40:48張騰騰張夢嬌王婉婷居正姬雨思朱蝶
        生物化工 2020年4期

        張騰騰,張夢嬌,王婉婷,居正,姬雨思,朱蝶

        (亳州學(xué)院中藥學(xué)院,安徽亳州 236800)

        白芍始載于古籍《神農(nóng)本草經(jīng)》中[1],亦別名為芍藥,來源于毛莨科植物芍藥(Paeonia lactitlora Pall.)的干燥根,其性苦、酸,微寒,歸肝和脾經(jīng),是聞名的大宗中藥材,具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、柔肝止痛和平抑肝陽的功效[2],古籍中曰其“益脾、能與土中瀉木”[3]。白芍的有效部位是白芍總苷,包括芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷及氧化芍藥苷等眾多的單萜糖苷類化合物,是白芍的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[4]?,F(xiàn)代藥理表明,白芍總苷具有鎮(zhèn)痛、抗炎以及保肝等多種作用[5-6]。李馳[7]在研究亳白芍中化學(xué)成分時(shí)也提到,其含有的單萜糖苷類化合物有鎮(zhèn)痛、抗抑郁和免疫調(diào)節(jié)等藥理作用。

        “亳白芍”是4大亳藥之一,為安徽省具有代表性的道地藥材之一。有學(xué)者認(rèn)為安徽的白芍栽培種質(zhì)混雜,需要加強(qiáng)對白芍資源的保護(hù)和利用,并從中發(fā)現(xiàn)優(yōu)異種質(zhì),以利于白芍的生產(chǎn)發(fā)展和優(yōu)良品種的選育[8]。安徽亳州地區(qū)主栽白芍有“線條”“線蒲棒”“蒲棒”“馬扎子”“二糟”等多個(gè)品系,對各個(gè)品系中有效成分含量的研究較少。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法(HPLC)對上述5個(gè)品系白芍的芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、氧化芍藥苷及苯甲酰芍藥苷4種有效成分進(jìn)行測定,為進(jìn)一步篩選出優(yōu)良品系、保持亳白芍的道地性奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        “線條”“線蒲棒”“蒲棒”“馬扎子”“二糟”樣品于2019年采集于安徽亳州市大楊鎮(zhèn)。

        1.2 儀器與試劑

        LC-20AD高效液相色譜儀,島津;FA2104N分析天平,上海菁海儀器有限公司;XS105電子天平,梅特勒-托利多儀器上海有限公司;UH4150紫外可見近紅外分光光度計(jì),HITACHI;DFY-400打粉機(jī),溫嶺市大機(jī)械有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋,上海江星儀器有限公司;DGT-G電熱鼓風(fēng)干燥箱,合肥華德利科學(xué)器材有限公司;JK-200DB超聲波清洗儀,合肥金尼克機(jī)械制造有限公司。

        苯甲酰芍藥苷對照品,批號19103002,成都普菲德生物技術(shù)有限公司;氧化芍藥苷對照品,批號19053107,成都普菲德生物技術(shù)有限公司;芍藥內(nèi)酯苷對照品,批號19011503,成都普菲德生物技術(shù)有限公司;芍藥苷對照品,批號110736-201943,中國食品藥品檢定研究院。乙腈(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、甲醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),色譜級;磷酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),優(yōu)級純;無水乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),分析純;屈臣氏純凈水。

        1.3 試驗(yàn)方法

        1.3.1 色譜條件

        色譜柱為Waters XBridge C18(0.46 cm×25 cm,5 μm);流動相A為0.015%磷酸溶液,B為乙腈;梯度洗脫程序?yàn)椋? min(92% A),5 min(88% A),17.5 min(87% A),20 min(86% A),38 min(80% A),48 min(70% A),63 min(40% A),73 min(92% A);檢測波長258 nm(氧化芍藥苷),230 nm(其余3種成分);柱溫30 ℃,流速 0.8 mL/min,進(jìn)樣量 10 μL。

        1.3.2 溶液制備

        1.3.2.1 對照品溶液的制備

        精密稱定芍藥內(nèi)酯苷2.36 mg,定容于10 mL容量瓶中;精密稱定氧化芍藥苷0.27 mg、苯甲酰芍藥苷0.46 mg、芍藥苷13.12 mg,分別定容于25 mL容量瓶中,加色譜級甲醇定容至刻度線處,搖勻,即得4種對照品貯備液。

        1.3.2.2 供試品溶液的制備

        稱取0.5 g白芍粉末(過80目篩)置于錐形瓶中,移取25 mL 50%乙醇溶液加入上述錐形瓶中,稱重,然后置于水浴鍋中加熱回流25 min后取出冷卻,補(bǔ)足減失重量,搖勻,用0.45 μm有機(jī)系濾頭過濾,取濾液。

        1.3.3 方法學(xué)考察

        1.3.3.1 線性關(guān)系考察

        分別精密移取氧化芍藥苷對照品溶液0.1 mL、0.4 mL、0.7 mL、1.0 mL、1.3 mL,芍藥內(nèi)酯苷對照品溶液0.6 mL、1.1 mL、1.6 mL、2.1 mL、2.6 mL,芍藥苷對照品溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL,苯甲酰芍藥苷對照品溶液0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL,置于25 mL容量瓶中,用甲醇(色譜級)定容,搖勻后制成4種混合對照品溶液。在“1.3.1”項(xiàng)色譜條件下,進(jìn)樣。以相應(yīng)對照品質(zhì)量X(μg)為橫坐標(biāo),色譜峰面積Y為縱坐標(biāo),計(jì)算線性回歸方程。

        1.3.3.2 精密度試驗(yàn)

        吸取同一混合對照品溶液10.0 μL,按照“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件,連續(xù)進(jìn)樣6次,分別計(jì)算4種化合物色譜峰峰面積的RSD值。

        1.3.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

        取同一樣品,按照供試品溶液操作方式進(jìn)行處理。在“1.3.1”項(xiàng)色譜條件下,連續(xù)進(jìn)樣12 h,每針間隔3 h,分別計(jì)算4種化合物色譜峰峰面積的RSD值。

        1.3.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

        稱取同一樣品6份,分別按照“1.3.2”條件制成供試品溶液。在“1.3.1”項(xiàng)色譜條件下,分別進(jìn)樣測定,記錄并計(jì)算4種化合物峰面積的RSD值。

        1.3.3.5 加樣回收率

        取已知含量的亳白芍樣品粉末5份,每份約0.25 g,精密稱定。按1∶1分別加入4種對照品適量,按“1.3.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液,按“1.3.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定,記錄相應(yīng)成分的色譜峰面積,計(jì)算回收率。

        1.3.4 樣品含量測定

        取“線條”“線蒲棒”“蒲棒”“馬扎子”“二糟”5個(gè)品系亳白芍,按照“1.3.2”項(xiàng)下制備供試品溶液,按“1.3.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 4種有效成分色譜圖

        白芍混合對照品中4種化學(xué)成分的出峰時(shí)間基本與亳白芍樣品中4種化學(xué)成分的出峰時(shí)間一致。

        圖1 混合對照品與亳白芍樣品色譜圖

        2.2 方法學(xué)考察

        2.2.1 線性關(guān)系

        在線性關(guān)系考察中,氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷及苯甲酰芍藥苷在其各自的線性范圍內(nèi),相關(guān)系數(shù)分別是0.999 3、0.999 8、0.999 0、0.999 9,表明線性關(guān)系較好,其線性回歸方程如表1所示。

        2.2.2 精密度

        精密度實(shí)驗(yàn)中,氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷及苯甲酰芍藥苷面積的RSD分別為0.27%、0.32%、0.25%、0.27%,表明精密度良好。

        表1 線性關(guān)系考察表

        2.2.3 穩(wěn)定性

        穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中,氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷及苯甲酰芍藥苷面積的RSD分別為0.31%、0.12%、0.10%、0.12%,表明溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

        2.2.4 重復(fù)性

        重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中,氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷及苯甲酰芍藥苷峰面積RSD分別為0.59%、0.80%、0.33%、0.12%,表明該法重復(fù)性良好。

        2.2.5 加樣回收率

        在加樣回收率實(shí)驗(yàn)中,氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷及苯甲酰芍藥苷的平均回收率分別為100.75%、98.67%、98.11%、98.34%,從表2可以看出,該法回收率較好。

        2.3 樣品含量

        如表3所示,為不同品系亳白芍藥材中4種成分含量。若以芍藥苷含量為考察指標(biāo),則5種品系含量由高到低依次為二糟>線蒲棒>蒲棒>馬扎子>線條;若以4種單萜苷總含量為考察指標(biāo),則二糟>線蒲棒>馬扎子>蒲棒>線條。

        表2 4種單萜苷成分的加樣回收率測定

        表3 不同品系亳白芍藥材中4種成分含量

        3 結(jié)論

        不同品系亳白芍的4種單萜苷含量及總含量各不同,以芍藥苷含量和以四種單萜苷總含量為考察指標(biāo)時(shí),五種品系中芍藥苷含量和四種單萜苷的總含量排名進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)不同品系亳白芍的排名存在部分差異,表明不同品種亳白芍質(zhì)量存在優(yōu)劣。

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