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        響應曲面法優(yōu)化雷公藤甲素的微波萃取工藝

        2020-08-27 06:40:44曾晶朱龍
        生物化工 2020年4期
        關(guān)鍵詞:甲素雷公藤微波

        曾晶,朱龍

        (1.湘南學院基礎(chǔ)醫(yī)學院,湖南郴州,423000;2.深圳東陽光藥業(yè)有限公司,廣東深圳,518000)

        雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook F,TwHF)又名黃藤根、斷腸草、菜蟲藥、南蛇根和旱禾花等,為衛(wèi)矛科雷公藤屬植物,是一個有著上千年應用歷史的中藥。其主要活性成分雷公藤甲素(Triptolide,TPL)是一種環(huán)氧二萜內(nèi)酯化合物[1-3],結(jié)構(gòu)式見圖1。大量體內(nèi)和體外的研究證明,雷公藤甲素具有抗炎、免疫抑制、抗癌和抗HIV病毒等藥理作用,在臨床上治療風濕性關(guān)節(jié)炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和腎病綜合癥等疾病療效顯著[4-5]。

        圖1 雷公藤甲素的結(jié)構(gòu)式

        近年來,越來越多的研究集中于雷公藤甲素提取方法的優(yōu)化,目前普遍采用的方法為水提醇沉法、乙酸乙酯和氯仿等有機溶劑萃取[6-7]。然而,這些方法具有產(chǎn)量低、污染大、程序復雜和耗時長等缺點[8-10]。為提高產(chǎn)品的回收率和資源的利用率,本實驗采用微波輔助萃取法對雷公藤甲素進行提取分離,并在單因素試驗的基礎(chǔ)上,進一步通過響應曲面法(Response surfacemethodology,RSM)優(yōu)化微波萃取過程中的各因素,為規(guī)模生產(chǎn)提供有價值的工藝參數(shù),以促進新藥的開發(fā)。

        1 材料與方法

        1.1 實驗儀器

        LC-20AD高效液相色譜儀,日本島津,G80F20CN2L-B8RO型微波爐,格蘭仕微波爐電器有限公司,RE-3000D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠,十萬分之一電子天平,梅特勒-托利多公司。

        1.2 樣品和試劑

        雷公藤(湖南蜂祥中藥材有限公司);雷公藤甲素對照品,純度>98%,上海源葉生物科技有限公司;乙腈,色譜純,上海阿拉??;乙醇(上海阿拉丁)等其他試劑均為分析純。

        1.3 試驗方法

        1.3.1 供試品制備

        將雷公藤干燥根粉碎后過60目篩,得到雷公藤粉末。稱取雷公藤粉末1.00 g,加入一定量乙醇溶劑,按照不同的料液比、萃取時間進行微波萃取、離心,吸取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥,采用中性氧化鋁層析柱進行富集。

        1.3.2 高效液相色譜檢測條件

        Ultimate XB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相A:水;流動相B:乙腈。洗脫梯度:0~24 min,10%~50% B;24~25 min,50~10% B,25~30 min,10% B,檢測波長218 nm,柱溫為室溫,流速1 mL/min,進樣量20 μL。

        1.3.3 標準曲線的繪制

        精密稱取雷公藤甲素對照品7.0 mg,加入50%乙腈水溶液制成7 mg/mL的儲備液。再逐級稀釋,最終得到濃度分別為 5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL和80 μg/mL的對照品溶液。按2.2項下色譜條件測定,以對照品濃度為橫坐標,以峰面積為縱坐標繪制標準曲線,得到標準曲線為Y=2.137×106x+576.8(R2=0.998 2),在 5~80 μg/mL線性良好。

        1.3.4 單因素試驗

        選擇乙醇體積分數(shù)、料液比和微波時間這3個因素,考察其對雷公藤甲素得率的影響。其中,乙醇體積分數(shù)設(shè)置60%、70%、80%、90%和99.5%共5個水平;料液比設(shè)置1∶5、1∶10、1∶15、1∶20和1∶25(g∶mL)共5個水平;微波時間設(shè)置4 min、6 min、8 min、10 min和12 min共5個水平。

        2.5 響應曲面法優(yōu)化雷公藤甲素提取工藝

        以雷公藤甲素萃取得率為考查指標,在單因素試驗基礎(chǔ)上,以乙醇體積分數(shù)、料液比、微波時間為試驗因素,每因素選取3個水平進行響應曲面設(shè)計試驗。根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理,采用Design-Expert 10.0.7進行三因素三水平的響應面分析法優(yōu)化雷公藤甲素的提取工藝參數(shù),試驗因素及水平見表1。

        表1 試驗因素與水平表

        2 結(jié)果與分析

        2.1 單因素試驗結(jié)果

        乙醇體積分數(shù)對雷公藤甲素提取效果的影響如圖2所示,當乙醇體積分數(shù)不斷增大時,雷公藤甲素的得率先增大后減小,乙醇體積分數(shù)為80%時,得率最高。其原因可能是當乙醇體積分數(shù)較小時,雷公藤甲素的溶解度隨著乙醇體積分數(shù)的增大而增大,但乙醇體積分數(shù)較大時,溶劑極性變小,雷公藤甲素溶解度降低。

        料液比對雷公藤甲素提取效果的影響如圖3所示。在雷公藤粉末質(zhì)量一定的情況下,隨著提取液體積的不斷增大,雷公藤甲素的得率先增大后趨于平緩,當料液比為1∶15(g/mL)時,得率最大。其原因可能是隨著溶劑用量的增加,溶于溶劑中的雷公藤甲素增多,但溶劑用量達到一定值后,溶于溶劑中的雷公藤甲素的量不再改變。

        圖2 乙醇體積分數(shù)對雷公藤甲素得率的影響

        圖3 料液比對雷公藤甲素得率的影響

        微波時間對雷公藤甲素提取效果的影響如圖4所示,隨著微波時間的不斷增大,雷公藤甲素的得率先增大后減小,可能是因為溫度升高會導致分子熱運動加快,有利于雷公藤甲素的提取,但時間過長,則會導致雷公藤甲素分解。當微波時間為8 min時,有最大得率。

        圖4 微波時間對雷公藤甲素得率的影響

        2.2 雷公藤甲素提取響應面分析試驗結(jié)果

        以雷公藤甲素得率為響應值,利用Design-Expert 10.0.7軟件進行分析,得到回歸方程為:得率=1.19+0.078A+0.076B+0.15C-0.027AB-8.75×10-3AC+0.016BC-0.11A2–0.09B2–0.044C2,方差分析結(jié)果如表2所示。

        由表2可知,影響雷公藤甲素得率的因素順序為:微波時間>乙醇體積分數(shù)>料液比。其中,微波時間為極顯著因素,乙醇體積分數(shù)和料液比為顯著因素,整體模型達到了極顯著水平(P<0.01)。模型的R2為0.913 3,失擬項不顯著(P>0.05),說明試驗模型擬合充分,可靠性高。

        表2 回歸模型方差分析結(jié)果

        各因素對響應值的影響可通過響應曲面表示,結(jié)果見圖5~7。從圖5可看出,當料液比固定不變時,雷公藤甲素得率隨著乙醇體積分數(shù)的增大出現(xiàn)先升高后降低的趨勢;當乙醇體積分數(shù)固定不變時,雷公藤甲素得率隨著料液比的增大而增大。當乙醇體積分數(shù)為76%~95%,料液比為1∶(14~23)時,雷公藤甲素得率接近最大值。

        圖5 乙醇體積分數(shù)和料液比對雷公藤甲素得率的交互影響

        由圖6可見,當微波時間固定不變時,雷公藤甲素得率隨著乙醇體積分數(shù)的增大出現(xiàn)先升高后降低的趨勢;當乙醇體積分數(shù)固定不變時,雷公藤甲素得率隨著微波時間的增大出現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當乙醇體積分數(shù)為76%~95%,微波時間在7~10 min時,雷公藤甲素得率接近最大值。

        圖6 乙醇體積分數(shù)和微波時間對雷公藤甲素得率的交互影響

        由圖7可見,當微波時間固定不變時,雷公藤甲素得率隨著料液比的增大而增大;當料液比固定不變時,雷公藤甲素得率隨著微波時間的增大出現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當料液比為1∶(14~23),微波時間為7~10 min時,雷公藤甲素得率接近最大值。

        圖7 料液比和微波時間對雷公藤甲素得率的交互影響

        通過Design-Expert 10.0.7軟件得到雷公藤甲素的最佳微波提取條件為:乙醇體積分數(shù)84.9%,料液比1∶19.7,微波時間7 min??紤]實際操作的可行性,確定最佳提取條件為:乙醇體積分數(shù)85%,料液比1∶20,微波時間7 min。為了驗證試驗的準確性,在此條件下進行3次平行試驗,得到雷公藤甲素的得率的平均值為1.31×10-3%,與模型預測值接近,說明利用此模型可以確定雷公藤甲素微波萃取的最佳提取工藝條件。

        3 結(jié)論

        本文在單因素分析的基礎(chǔ)上,用響應曲面法建立了以雷公藤甲素為響應值,以乙醇體積分數(shù)、料液比和微波時間為試驗因子的回歸模型,此模型擬合良好。經(jīng)優(yōu)化得到最佳萃取條件為:乙醇體積分數(shù)85%,料液比1∶20,微波時間7 min。本實驗為提取雷公藤甲素提供了一種有效方法,為規(guī)模生產(chǎn)提供了有價值的工藝參數(shù)。

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