張 琨 殷麗麗 韓志平 陳枝文 王一衡

（1.山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西大同大學(xué)設(shè)施農(nóng)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，山西 大同 037009；2.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，天津 西青 300384）

黃花菜（Hemerocallis citrinaBaroni）屬百合科萱草屬，為我國(guó)一種藥食同源的特色蔬菜[1]。我國(guó)是世界上黃花菜種質(zhì)資源最豐富的國(guó)家，現(xiàn)有黃花菜品種60余種[2]。由于黃花菜不同品種間的形態(tài)差別不大，加之長(zhǎng)期進(jìn)行無性繁殖，缺乏新的優(yōu)良基因的融合，使品種間的遺傳差異不斷縮小，品種退化日益凸顯。

雜交是作物育種的主要手段，雖操作簡(jiǎn)單，但結(jié)實(shí)率較低，很難獲得成功?；ǚ凵盍?qiáng)弱是決定雜交成功與否的關(guān)鍵。明確黃花菜花粉生活力的測(cè)定方法及測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)選育雜交新品種非常重要。近幾年對(duì)黃花菜的研究主要集中在栽培管理技術(shù)、組織培養(yǎng)快繁、加工保鮮工藝及功能成分分析等方面[3～6]，對(duì)其花粉生活力的研究不夠系統(tǒng)。目前花粉生活力測(cè)定方法主要有兩種，即染色法和花粉離體萌發(fā)法。染色法因方便快捷、操作簡(jiǎn)單，被廣泛應(yīng)用于不同植物的花粉檢測(cè)；花粉離體萌發(fā)法檢測(cè)花粉生活力最準(zhǔn)確，花粉離體萌發(fā)能力是判斷花粉生活力最有效的指標(biāo)[7]。大量研究表明，培養(yǎng)基中蔗糖、硼酸等主要成分對(duì)花粉萌發(fā)及花粉管伸長(zhǎng)具有不可替代的重要作用[8]。蔗糖是供給花粉離體萌發(fā)最重要的能量物質(zhì)，其濃度決定了花粉離體萌發(fā)的成敗。本研究以黃花菜為材料，比較不同染色法的染色效果和不同蔗糖濃度對(duì)黃花菜花粉離體萌發(fā)的影響，以期篩選出快速而準(zhǔn)確的黃花菜花粉生活力測(cè)定方法，為黃花菜人工授粉及品種改良提供最佳的工作方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試黃花菜品種為大同花。大同花黃花菜于2015年引種于山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地，田間管理措施按常規(guī)。2019 年9 月植株盛花期開始，每天于晴天上午8～10 時(shí)從生長(zhǎng)良好、無病蟲害的黃花菜植株上采摘即將開放的花蕾帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花粉染色劑篩選

取現(xiàn)采的花蕾，將花藥連同花絲拔下，用鑷子抖動(dòng)離花藥較近的花絲，使花粉落至載玻片的中央，分別使用1%醋酸洋紅、1%亞甲基藍(lán)和0.5%氯化三苯基四氮唑（TTC）對(duì)黃花菜花粉常溫染色15 min。記錄不同處理的染色結(jié)果，篩選出適宜的花粉染色劑。每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)進(jìn)行3個(gè)視野的觀察。

1.2.2 染色時(shí)間研究

取現(xiàn)采的花蕾，將花粉抖落至載玻片的中央，滴加1～2 滴篩選出的染液。設(shè)置6 個(gè)染色時(shí)間，分別為10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min。常溫培養(yǎng)完成染色后，用顯微鏡觀察各染色時(shí)間處理花粉的染色結(jié)果，計(jì)算染色率[9]，篩選出最佳的花粉染色時(shí)間。每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)進(jìn)行3個(gè)視野的觀察。

1.2.3 不同蔗糖濃度下黃花菜花粉萌發(fā)率測(cè)定

采用液體培養(yǎng)法，在300 mg/L硼酸加50 mg/L氯化鈣的基本培養(yǎng)基上[10～11]設(shè)置6個(gè)蔗糖濃度梯度，分別為0 g/L、30 g/L、60 g/L、90 g/L、120 g/L、150 g/L。將花粉抖落在載玻片的中央，滴加2 滴配制好的培養(yǎng)基，將載玻片放入鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中常溫培養(yǎng)6 h，然后制成壓片進(jìn)行顯微觀察。每個(gè)處理3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)進(jìn)行3個(gè)視野的觀察?；ǚ勖劝l(fā)以花粉管長(zhǎng)度超出花粉粒直徑為判斷依據(jù)[12]，計(jì)算萌發(fā)率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 24.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同染色劑對(duì)黃花菜花粉活力測(cè)定結(jié)果的影響

黃花菜花粉染色顯微觀察結(jié)果如圖1所示。醋酸洋紅染色下，花粉粒均被染為鮮紅色，在顯微鏡下差異極小，無法判斷花粉活性（圖1a）；用TTC 染液染色的花粉，花粉粒均被染為暗紅色，在顯微鏡下差異也不明顯（圖1b）；當(dāng)使用亞甲基藍(lán)染色時(shí)，在顯微鏡下觀察到有活力的花粉被染成了藍(lán)色，而喪失活力的花粉則沒有著色，顯微鏡下差異顯著，效果明顯（圖1c）。由此可見，醋酸洋紅染液和TTC 染液不宜用于測(cè)定黃花菜花粉生活力，亞甲基藍(lán)較適宜用于測(cè)定黃花菜花粉生活力。

圖1 不同染色劑對(duì)黃花菜花粉生活力測(cè)定的結(jié)果

2.2 不同染色時(shí)間對(duì)黃花菜花粉生活力測(cè)定結(jié)果的影響

根據(jù)染色劑的篩選試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)亞甲基藍(lán)的染色時(shí)間作進(jìn)一步研究試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如圖2 所示。染色時(shí)間為10～25 min 時(shí)，黃花菜花粉染色率隨亞甲基藍(lán)染色時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，花粉的平均染色率分別達(dá)到34.37%、37.70%、48.64%和52.47%；染色10 min 和15 min 處理，花粉染色率差異不顯著，20 min 染色處理花粉平均染色率顯著高于10 min 和15 min 染色處理，但較25 min 染色處理差異不顯著；染色時(shí)間繼續(xù)增加，達(dá)到30 min、35 min 時(shí)，染色率分別為49.81%和52.48%，較20 min 染色處理均無顯著差異。由此可見，測(cè)定黃花菜花粉生活力的染色時(shí)間以20 min為佳。

圖2 染色時(shí)間對(duì)黃花菜花粉染色率的影響

2.3 蔗糖濃度對(duì)黃花菜花粉萌發(fā)的影響

蔗糖濃度對(duì)黃花菜花粉萌發(fā)的影響見表1。

表1 各處理黃花菜花粉的萌發(fā)率

由表1 可知，黃花菜花粉萌發(fā)率隨培養(yǎng)基中蔗糖濃度的增加呈先升高后降低趨勢(shì)。培養(yǎng)基中不含蔗糖時(shí)，黃花菜花粉萌發(fā)率最低，僅為4.22%，且花粉管伸長(zhǎng)不明顯（見圖3a）；當(dāng)蔗糖濃度增至30 g/L 時(shí)，黃花菜花粉萌發(fā)率達(dá)到最大值，為59.18%，萌發(fā)花粉的花粉管長(zhǎng)度也最長(zhǎng)（見圖3b）；蔗糖濃度繼續(xù)增加至60 g/L時(shí)，黃花菜花粉萌發(fā)率略有下降，為52.33%，較30 g/L 處理差異不顯著，花粉管長(zhǎng)度也較長(zhǎng)，僅次于30 g/L 處理（見圖3c）；當(dāng)蔗糖濃度升至90 g/L時(shí)，黃花菜花粉萌發(fā)率迅速降低，僅為14.31%，較30 g/L處理和60 g/L處理差異達(dá)極顯著，花粉管長(zhǎng)度下降（見圖3 d）；當(dāng)蔗糖濃度為120 g/L 和150 g/L 時(shí)，花粉萌發(fā)率繼續(xù)下降，分別為6.28%和5.48%，較不加蔗糖處理差異不顯著，但均顯著低于90 g/L 處理，花粉管形態(tài)粗短（見圖3e、圖3f）。由此可見，黃花菜花粉離體萌發(fā)最適蔗糖濃度為30 g/L。

圖3 不同蔗糖濃度對(duì)黃花菜花粉管生長(zhǎng)的影響

3 結(jié)論與討論

準(zhǔn)確鑒定花粉活力是植物雜交育種的基礎(chǔ)條件。通過對(duì)花粉進(jìn)行染色制片，即可利用顯微鏡觀察快速檢測(cè)花粉活力。目前，用于檢測(cè)花粉活力的染色方法有醋酸洋紅染色法、TTC染色法、亞甲基藍(lán)染色法和I2-KI 染色法等，但不同植物的鑒定方法常因物種差異而各不相同。研究表明，TTC 染色法是鑒定金娃娃萱草花粉生活力的最佳染色方法，染色時(shí)間為35～40 min時(shí)染色效果最佳[13]；I2-KI適用于四川牡丹花粉生活力的快速鑒定[14]；醋酸洋紅染色法適用于油菜花粉生活力的測(cè)定[15]；次亞甲基藍(lán)和α-萘酚-聯(lián)苯胺適用于快速檢測(cè)貼梗海棠花粉的生活力[16]。本研究采用3 種不同染色法對(duì)黃花菜花粉生活力進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)用醋酸洋紅和TTC 染液染色的花粉顏色差異極小，而在亞甲基藍(lán)作用下，有生活力的花粉被染成了藍(lán)色，與無生活力花粉顏色相比差異顯著。因此，亞甲基藍(lán)染色法可作為一種經(jīng)濟(jì)、便捷、安全的方法用于黃花菜花粉生活力的快速檢測(cè)。除染色劑外，染色時(shí)間對(duì)染色效果也有一定的影響。染色時(shí)間太短，染色劑與花粉中的相關(guān)物質(zhì)或酶反應(yīng)不充分，染色率低；染色時(shí)間過長(zhǎng)，又可能降低參與染色反應(yīng)的酶活性，影響檢測(cè)準(zhǔn)確性，同時(shí)也不利于染色法的快速檢測(cè)，影響檢測(cè)效率。本試驗(yàn)在明確亞甲基藍(lán)染色法為黃花菜花粉生活力檢測(cè)最適宜方法的基礎(chǔ)上，對(duì)亞甲基藍(lán)的染色時(shí)間做了進(jìn)一步研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)染色20 min 時(shí)黃花菜花粉平均染色率較高，之后隨著染色時(shí)間的增加，平均染色率有所提高，但較染色20 min 差異并不顯著。綜上所述，利用亞甲基藍(lán)染色20 min，即可對(duì)黃花菜花粉生活力實(shí)現(xiàn)快速測(cè)定。

選用染色法鑒定花粉生活力，雖然經(jīng)濟(jì)便捷，容易掌握，但因染色法是通過花粉中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量或代謝情況反映花粉生活力，衰老或死亡的花粉也可能會(huì)著色，且染色后有活性與無活性染色界線不易分辨，會(huì)造成測(cè)定值偏高，不能準(zhǔn)確反映花粉的生活力[17～18]。離體萌發(fā)法雖然需要較長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)，但可實(shí)現(xiàn)對(duì)花粉生活力的完全定量檢測(cè)[18]。蔗糖是花粉離體培養(yǎng)最重要的能量物質(zhì)，其不僅能維持外界環(huán)境的滲透平衡[19]，還可在一定程度上減少微生物的污染（大部分微生物生長(zhǎng)所需碳源為葡萄糖）。適宜濃度的蔗糖可在一定程度上緩解花粉破裂，促進(jìn)花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)。蔗糖濃度過低易使花粉吸水漲破，導(dǎo)致花粉內(nèi)容物流出，而濃度過高又會(huì)造成花粉脫水，導(dǎo)致其活性降低，對(duì)花粉萌發(fā)產(chǎn)生明顯的抑制作用[20～21]。本試驗(yàn)結(jié)果印證了上述結(jié)論，較低或較高濃度的蔗糖均不利于黃花菜花粉萌發(fā)，黃花菜花粉離體萌發(fā)適宜的蔗糖濃度為30 g/L。

為提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性，可將亞甲基藍(lán)染色法與花粉離體萌發(fā)法結(jié)合起來，即先利用染色法判斷黃花菜花粉生活力的基本情況，再通過離體萌發(fā)法實(shí)現(xiàn)花粉生活力的定量檢測(cè)。在后續(xù)研究中，為進(jìn)一步提高黃花菜花粉的萌發(fā)率，還需對(duì)培養(yǎng)過程中硼酸、溫度等條件進(jìn)行研究，同時(shí)應(yīng)擴(kuò)大選材范圍，分析和掌握不同品種黃花菜花粉生活力的差異，為開展黃花菜雜交育種工作提供更好的方法。