王雨晨, 王延梅

(中國科學技術大學高分子科學與工程系, 安徽 合肥 230026)

毛細管電泳(CE)是以高壓直流電場為驅動力、毛細管作為分離通道,根據毛細管內樣品的淌度以及分配行為等進行分離的一項液相分離技術[1]。毛細管分離技術使得分析科學從μL水平上升至nL水平,并且具有分析速度快、分離效率高、樣品消耗量少、經濟環(huán)保等特點,在藥物研究、醫(yī)學臨床診斷、環(huán)境監(jiān)控分析和食品分析等多個領域有著廣泛的應用。然而在蛋白質分離分析領域,常用的熔融硅毛細管容易吸附蛋白質,導致電滲流不穩(wěn)定,使得分離結果重現(xiàn)性變差[2];此外,商用CE中常用的紫外檢測器(UV)光程短,使得CE-UV的檢測靈敏度往往不能達到低豐度蛋白質的直接分析要求[3,4]。因此尋找能夠阻止蛋白質吸附、同時能夠提高CE-UV檢測靈敏度的涂層是毛細管電泳分離分析蛋白質的重要課題之一。

圖 1 幾種常用的引發(fā)劑、終止劑和2-唑啉單體的結構式Fig. 1 Structural formulas of several initiators, termin-ators and 2-oxazoline in common use

本文將結合近年來本課題組以及國內外其他研究者的相關研究工作,對PMOXA在毛細管電泳分離蛋白質中的應用進行總結和評述。

1 聚(2-甲基-2-唑啉)的抗蛋白質吸附作用

在用CE分離分析蛋白質之前,采用聚合物修飾毛細管內壁是解決熔融硅毛細管內壁吸附蛋白質的常用方法之一。聚合物涂層通?？筛鶕c毛細管內壁鍵合方式的不同分為共價鍵涂層和非共價鍵涂層。共價鍵涂層是指聚合物主要通過共價鍵鍵合在毛細管內壁形成的涂層。共價鍵涂層壽命長，穩(wěn)定性好，分離效率高。但是由于涂層的制備通常需要單體在毛細管內聚合,制備工藝復雜,聚合反應難以控制,容易造成涂層的不均一性,最終使檢測結果重現(xiàn)性變差[20]。非共價鍵涂層是指聚合物以非共價鍵鍵合在毛細管內壁形成的涂層,通常將組成和結構已知的聚合物配成溶液,充入毛細管,聚合物通過與毛細管內壁之間的氫鍵、靜電引力、疏水基團間的相互作用等在毛細管內壁形成涂層。非共價鍵涂層毛細管制備過程簡單,涂覆過程可一步完成,但由于非共價鍵作用力較弱,在分離過程中涂層易被緩沖溶液沖出毛細管,造成涂層不穩(wěn)定。

受貽貝類海洋生物足絲分泌的黏液在潮濕的環(huán)境下依然具有超強黏附性的啟發(fā),Lee等[21]在pH 8.5的緩沖液和氧氣存在的條件下,以多巴胺(DA)為單體,在不同基質(如貴金屬、金屬氧化物、二氧化硅、有機高分子等)的材料上制備出具有強黏附性的聚多巴胺(PDA)涂層[22-24],該涂層在一個很寬的pH值范圍內(pH=1.0～12.0)均保持良好的穩(wěn)定性,并且可以進一步與帶有功能團(如-NH2、-SH等)的聚合物進行席夫堿或邁克爾加成反應[25-27]。

Xiang等[28]首先在不同材料(如玻璃、金片等)表面修飾PDA涂層,然后將末端帶有氨基的聚(2-甲基-2-唑啉)(PMOXA-NH2)通過PDA接枝在材料表面,即通過兩步法制備聚多巴胺接枝聚(2-甲基-2-唑啉)(PDA-g-PMOXA)涂層(見圖2)。表面等離子共振(SPR)結果表明,溶菌酶在PDA-g-PMOXA修飾的芯片表面的吸附量是79.39 ng/cm2,而在聚多巴胺接枝聚乙二醇單甲醚(PDA-g-mPEG)修飾的芯片表面的吸附量是101.20 ng/cm2,說明PDA-g-PMOXA涂層的抗蛋白質吸附性能更好。水接觸角的測試結果表明,PDA-g-PMOXA涂層比PDA-g-mPEG涂層更穩(wěn)定。CE實驗結果表明,PDA-g-PMOXA涂層毛細管在10 min內能有效地分離出溶菌酶、細胞色素C、核糖核酸酶A、α-胰凝乳蛋白酶原A、胰蛋白酶抑制劑、肌球素這6種酸、堿、中性蛋白質混合物,遷移時間的相對標準偏差(RSD)均小于0.05%,理論塔板數(N)大于8.0×104/m,并且能將雞蛋清中的酸性蛋白質和堿性蛋白質有效分離。

為了進一步提高PMOXA涂層毛細管阻抗蛋白質吸附的性能,Zhang等[29]通過DA輔助共沉積法(一步法)來提高PMOXA在毛細管內壁的接枝密度。他們將部分水解的聚(2-甲基-2-唑啉)(PMOXA-EI)與DA混合,通過DA的氧化聚合以及PMOXA-EI主鏈中的亞氨基和PDA之間的邁克爾加成反應,分別制備了聚(2-甲基-2-唑啉-乙烯亞胺)的一次(PDA/PMOXA-EI)及二次(PDA/PMOXA-EI+PMOXA-EI)涂層毛細管(見圖2)。這種涂層毛細管對4種堿性蛋白質的混合物(溶菌酶、細胞色素C、核糖核酸酶A和α-胰凝乳蛋白酶原A)可進行有效分離,N值最高可達5.4×105/m,遷移時間的RSD值均小于0.17%。在低pH值時(pH 2.53), PDA/PMOXA-EI+PMOXA-EI聚合物鏈上的仲胺會發(fā)生質子化,使涂層管帶正電荷,可以與同樣質子化的三聚氰胺(MEL)間發(fā)生靜電排斥作用,阻止MEL在毛細管內壁的吸附,因此該涂層毛細管可用于奶粉中MEL的檢測。研究表明,在最佳實驗條件下,MEL的檢出限為0.097 μg/mL,奶粉中可以檢測到MEL的最低量為4 mg/kg, MEL的加標回收率為92.13%～102.47%,相對標準偏差為2.07%～4.98%,并且涂層在45 d內仍保持良好的穩(wěn)定性。該方法使得實際奶粉樣品中MEL的檢測更加經濟有效。

圖 2 以PDA為黏合層制備不同類型PMOXA涂層的示意圖Fig. 2 Diagram of preparing different types of PMOXA coatings using PDA as the anchor PDA: polydopamine; PMOXA: poly(2-methyl-2-oxazoline); PDA-g-PMOXA: polydopamine-graft-poly (2-methyl-2-oxazoline); PMOXA-EI: poly (2-methyl-2-oxazoline-co-ethyleneimine); PEI-g-PMOXA: poly(ethyleneimine)-graft-poly (2-methyl-2-oxazoline).

為了進一步提高PMOXA在毛細管內壁的覆蓋率,增強涂層的抗蛋白質吸附能力,Du等[30]根據之前多臂星形超支化聚乙烯亞胺接枝聚(2-甲基-2-唑啉)(PEI-g-PMOXA)的研究結果[31],以超支化分子聚乙烯亞胺(PEI)作為支架,合成了一系列結構明確、具有不同PMOXA接枝率和鏈長(分子量)的多臂星形超支化PEI-g-PMOXA,并采用DA輔助共沉積法(一步法)[32],快速將PEI-g-PMOXA固定在毛細管內壁(見圖2)。該涂層毛細管分離4種堿性蛋白質混合物(溶菌酶、細胞色素C、核糖核酸酶A和α-胰凝乳蛋白酶原A)時,所得峰的N值可達105量級;同一根PEI-g-PMOXA涂層毛細管連續(xù)分離30次后,4種蛋白質遷移時間的RSD均小于0.7%。基于PEI-g-PMOXA涂層管良好的穩(wěn)定性和優(yōu)異的抗蛋白質吸附性能,將其用于前沿分析毛細管電泳法(FACE)測定小分子陽離子藥物對乙酰氨基酚(APAP)與牛血清白蛋白(BSA)之間相互作用的參數。結果表明,連續(xù)3次分析的結合常數(Ka)和結合位點數(n)的RSD值分別為5.1%和1.4%,連續(xù)3 d的Ka和n的RSD值分別為9.0%和2.4%,所得結果與熒光光譜法以及其他文獻[33]中報道的結果相近,說明該方法具有較好的重復性和準確性。

除了以PDA為黏合層的方法外,Bai等[34]通過加熱的方法,在硅、玻璃等表面制得了PMOXA涂層。他們首先以甲基丙烯酸(MAA)為終止劑,終止MOXA的陽離子開環(huán)聚合反應,得到聚(2-甲基-2-唑啉)大分子單體(PMOXA-MA)。然后通過自由基共聚,合成了梳狀的聚(2-甲基-2-唑啉)-r-甲基丙烯酸縮水甘油酯(PMOXA-r-GMA)無規(guī)共聚物。Mao等[35]利用該梳狀共聚物中GMA組分中的環(huán)氧基團在加熱條件下可以與毛細管內壁的硅羥基發(fā)生化學反應這一特性,通過熱致固化的方法制備出PMOXA-r-GMA涂層毛細管。該涂層毛細管成功地分離了4種堿性蛋白質的混合物(溶菌酶、細胞色素C、核糖核酸酶A和α-胰凝乳蛋白酶原A),N值可達8.3×105/m,遷移時間的RSD值可低至0.1%。該涂層毛細管還可以定量檢測嬰幼兒奶粉中乳鐵蛋白(Lf)的含量,向嬰幼兒奶粉樣品中外加0.40 mg/mL的標準Lf后,檢測到Lf的含量是(0.39±0.02) mg/mL,回收率可達97.8%±5.1%。這種涂層毛細管在分析嬰幼兒奶粉樣品時前處理簡單,分離時間較短(6 min),涂層毛細管連續(xù)使用50次后,Lf遷移時間和峰面積的RSD值分別為1.1%和2.9%,為嬰幼兒奶粉中Lf的檢測提供了簡單可行的方法。

2 PMOXA對BSA和溶菌酶(Lyso)的在線富集及檢測信號放大作用

在CE-UV用于蛋白質的分析過程中,樣品進樣體積小，檢測光程短,導致樣品的檢測靈敏度不高,不能達到痕量蛋白質的直接檢測要求。解決上述問題的常見方法有:對樣品進行前處理以提高樣品的純度、重新設計檢測器、在線(on-line)富集目標分析物等[36,37]。其中在線富集技術不需要對儀器本身進行任何改造,主要通過改變目標分析物在毛細管內的遷移速率,使待測樣品發(fā)生堆積,從而提高待測樣品通過檢測器的濃度,達到提高檢測靈敏度的目的。常用的在線富集技術有堆積法、動態(tài)pH界面法、吹掃法、瞬間等速電泳法、毛細管涂層法等[38-41]。毛細管涂層法是指:將對蛋白質具有可逆吸附功能的聚合物涂覆在毛細管內壁,形成聚合物涂層毛細管,該涂層毛細管在某一條件下能吸附目標蛋白質,在另一條件下能將所吸附的目標蛋白質全部釋放,具有富集目標蛋白質,提高蛋白質分析靈敏度的功能。

這種具有可逆吸附功能的聚合物通常具有刺激響應性,它可以對外界的某種刺激(如溫度、pH值、光、溶劑、離子強度(I)等)做出相應的反應(如顏色、潤濕性、蛋白質吸附等變化)[42-44]。聚丙烯酸(PAA)是一類常見的具有pH響應性的聚合物,隨著環(huán)境pH值和離子強度的改變,PAA鏈在溶液中會溶脹和塌縮[45-47],從而達到對蛋白質的可控吸附與釋放。研究發(fā)現(xiàn),如果只是單純的PAA組成的聚合物刷,只能釋放出部分吸附的蛋白質;當PAA和具有抗蛋白質吸附的聚合物(如PEG)組成二元混合刷時[48-51],在一定條件下能吸附蛋白質,當改變條件時又能將所吸附的蛋白質幾乎全部釋放。Pan等[27]通過PDA將PMOXA和PAA依次接枝在不同的基底(如玻璃、硅、金等)上,制備了PMOXA/PAA二元混合刷。研究發(fā)現(xiàn),當PAA的理論鏈長較PMOXA長,在pH=5.0(I=10-5mol/L)時,由于PAA鏈處于伸展狀態(tài),涂層可以吸附大量的BSA;而在pH=9.0(I=10-1mol/L)時,由于PAA鏈中羧基的解離,使涂層帶負電,并且由于鹽效應,PAA鏈發(fā)生塌縮,因此可將之前吸附的帶負電荷的BSA釋放出來,同時處于涂層表面的PMOXA會進一步阻止蛋白質的吸附。Gong等[52]進一步研究發(fā)現(xiàn),當PAA的接枝密度約為PMOXA的一半,在pH=7.0(I=10-5mol/L)時,PAA鏈處于伸展狀態(tài),可以通過靜電作用吸附帶正電荷的Lyso;當pH=3.0(I=10-1mol/L)時,由于羧酸根的質子化以及鹽效應,PAA鏈塌縮,減弱了PAA與Lyso之間的靜電吸引作用,使之前吸附的Lyso得以釋放,同時暴露在外的PMOXA鏈阻止了Lyso的進一步吸附,此時Lyso的脫附率可達91.3%(見圖3)。

圖 3 BSA或Lyso在PMOXA/PAA混合刷上的吸附和解吸附Fig. 3 Adsorption and desorption of BSA or Lyso on the PMOXA/PAA mixed brushes BSA: bovine serum albumin; Lyso: lysozyme; PAA: polyacrylic acid; I: ion strength.

將上述具有pH和I響應性的PMOXA/PAA混合刷修飾到毛細管內壁,可以通過改變緩沖溶液的pH和I,調控涂層對目標蛋白質的吸附和釋放,釋放的蛋白質在電滲流和電泳的雙重作用下快速遷移,到達UV檢測器的蛋白質瞬時濃度大大增加,使目標蛋白質得到富集,CE-UV對目標蛋白質的檢測信號得到放大,從而達到提高低豐度蛋白質檢測靈敏度的目的(見圖4)。Liu等[53]通過PDA將PMOXA和PAA接枝在毛細管內壁,制備出PDA/PMOXA/PAA涂層毛細管,并將其用于BSA的在線富集。結果表明,在pH=5.0(I=10-5mol/L)時,涂層毛細管可吸附大量的BSA;在pH=9.0(I=10-1mol/L)時,吸附的BSA發(fā)生脫附。PDA/PMOXA/PAA涂層毛細管基于峰高和峰面積的靈敏度提高因子(SEF)分別為5 498和3 649,即BSA的稀溶液在聚合物涂層毛細管中得到了富集。Hou等[54]的研究結果表明,當PAA鏈長(12.5 nm)是PMOXA鏈長(8 nm)的1.56倍時,PDA/PMOXA/PAA涂層毛細管可以達到最佳的在線富集效果。在pH=7.0(I=10-5mol/L)時,Lyso可吸附在涂層毛細管內壁上;在pH=3.0(I=10-1mol/L)時,涂層與Lyso之間的靜電作用大大減弱,大部分吸附的Lyso得以釋放。該方法對Lyso的最低檢出限達到4.5×10-9mg/mL,檢測信號放大了1.0×105倍,極大提高了CE對Lyso的檢測靈敏度。

圖 4 PDA/PMOXA/PAA涂層毛細管對BSA或Lyso的在線富集機理Fig. 4 On-line preconcentration mechanism of BSA or Lyso in PDA/PMOXA/PAA coated capillaryEOF: electroosmotic flow.

3 結論與展望