張 劍, 張 博, 賀茂芳, 韓 祿, 高東羽, 劉春葉

(西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院, 陜西 西安 710021)

乙酰膽堿酯酶(AChE)是生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的一種關(guān)鍵性酶。在膽堿能突觸間,該酶能降解乙酰膽堿,終止神經(jīng)遞質(zhì)對突觸后膜的興奮作用,保證神經(jīng)信號在生物體內(nèi)的正常傳遞[1]。

阿爾茨海默癥是引起中老年人癡呆最常見的疾病,AChE抑制劑(AChEI)是當(dāng)前治療該疾病的主要藥物[2]。AChEI的藥理作用是抑制AChE的活性,從而維持神經(jīng)系統(tǒng)中乙酰膽堿的正常水平。因此,AChEI的篩選研究受到了廣泛關(guān)注[3-7]。目前,其篩選方法有比色法[8]、薄層色譜法(TLC)[9]、高效液相色譜法(HPLC)[10]、質(zhì)譜法(MS)[11]、熒光法[12]等等。由于毛細(xì)管電泳(CE)具有分離模式多、分離效率高、樣品消耗少等優(yōu)點(diǎn),近年來被廣泛應(yīng)用于酶學(xué)研究及抑制劑篩選等相關(guān)領(lǐng)域[13-18]。分段注入酶和底物溶液的毛細(xì)管電泳介導(dǎo)酶微反應(yīng)器技術(shù)操作簡單,實現(xiàn)了反應(yīng)和檢測的一體化,但每次運(yùn)行需更換新的酶溶液塞[15-16,18]。開管毛細(xì)管固定化酶微反應(yīng)器可重復(fù)使用、易調(diào)控,近年來受到廣泛關(guān)注。靶標(biāo)酶的固定化可通過共價鍵[13,14]和離子鍵[17]來實現(xiàn),共價鍵法所得酶反應(yīng)器穩(wěn)定性好,但制備過程耗時較長,與之相比離子鍵合法則操作簡單快速。

建立快速地從天然產(chǎn)物中篩選AChEI的方法,將對臨床治療阿爾茲海默癥有積極的作用。天麻在臨床上被廣泛應(yīng)用于阿爾茲海默癥、帕金森、中風(fēng)、眩暈等腦部神經(jīng)損傷性疾病的治療。作為天麻的重要藥效成分之一,天麻素能夠抑制AChE的活性,增加腦內(nèi)乙酰膽堿的含量。本文以海美溴銨(HBD)修飾一段毛細(xì)管內(nèi)壁,使其帶正電荷,再通過離子鍵鍵合AChE制備固定化微量酶反應(yīng)器,采用CE法測定天麻素對AChE活性的抑制能力,從而評價CE在篩選AChEI上的優(yōu)勢。與文獻(xiàn)[17]相比,該方法對毛細(xì)管采用區(qū)域處理,過程更簡單、快捷。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與藥品

P/ACE MDQ毛細(xì)管電泳儀(美國貝克曼庫爾特有限公司); AX224ZH電子精密天平(奧豪斯儀器常州有限公司);KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司); PB-10 pH酸度計(德國塞多利斯科學(xué)儀器有限公司); UV-160A紫外可見分光光度計(上海精密儀器廠)等。

乙酰膽堿酯酶(220 u/g)、碘化乙酰硫代膽堿(AThC,≥98.0%,分析純)和5′5-二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)(≥99.0%,分析純)均購自索萊寶生物科技有限公司。天麻素(≥98.0%,分析純,上海安譜實驗科技股份有限公司);海美溴銨(≥94.0%,分析純,西格瑪試劑有限公司);聚二烯二甲基氯化銨溶液(≥20%,分析純,阿拉丁試劑有限公司,);磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉(≥98.0%,分析純,西安化學(xué)試劑廠);N,N-二甲基甲酰胺(≥99.5%,分析純,天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司);十二烷基硫酸鈉(SDS)(分析純,阿拉丁試劑有限公司);氫氧化鈉(分析純,天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠);濃鹽酸(≥36.0%,分析純,四川西隴科學(xué)有限公司);實驗用水均為去離子水(陜西娃哈哈乳品有限公司)等。

1.2 溶液配制

精密稱取乙酰膽堿酯酶0.050 0 g,用Tris-HCl緩沖溶液(pH 7.5,濃度20 mmol/L)溶解,得11 u/mL的AChE溶液,分裝于離心管中。精密稱取AThC 0.005 7 g,用去離子水2 mL溶解于離心管中,得10 mmol/L的AThC溶液。精密稱取HBD0.050 0 g,用去離子水溶解并定容于50 mL容量瓶中,得約0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的HBD溶液。

精密稱取天麻素0.0020 g，用去離子水2 mL溶解于離心管中，配制成1 g/L的天麻素溶液。用去離子水稀釋此天麻素母液，得到0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mg/L (即0、0.87、1.75、2.62、3.50、4.37和5.24 μmol/L)的天麻素溶液。

精密稱取磷酸氫二鈉0.7196 g、磷酸二氫鈉0.3127 g,分別加去離子水溶解,定容于100 mL容量瓶中,配成pH 8.0, 20 mmol/L 的磷酸鹽緩沖溶液(PBS緩沖液)。

1.3 毛細(xì)管內(nèi)壁改性

取70 cm的新毛細(xì)管柱(內(nèi)徑75 μm),分別用1 mol/L NaOH溶液、去離子水、1 mol/L HCl溶液、去離子水沖洗30、5、20、5 min。N2吹干。在0.015 MPa的壓力下,通入HBD溶液10 s,停留5 min,再用去離子水沖洗5 min,在毛細(xì)管內(nèi)壁吸附上一段正電荷涂層[13]。

1.4 固定化AChE微反應(yīng)器的制備

在0.015 MPa的壓力下向柱中注入AChE溶液10 s,柱中留置5 min,酶通過與HBD之間的靜電引力固定在毛細(xì)管柱內(nèi)壁上,得到一段1.5 cm長的酶溶液塞。用PBS緩沖液沖洗3 min,洗掉未固定的酶溶液,即得固定化AChE微反應(yīng)器。在離線狀態(tài)下,采用相同壓力向毛細(xì)管中壓入酶溶液,用直尺測量得到酶溶液塞的長度。

1.5 AChE微反應(yīng)器的活性考察

在不存在(或存在)抑制劑天麻素的條件下,將底物AThC(0.1 mmol/L)注入酶反應(yīng)器中(0.015 MPa×10 s);停留1 min后,將產(chǎn)物與未反應(yīng)的底物進(jìn)行電泳分離。在兩次運(yùn)行之間,將毛細(xì)管和電極浸入水中清潔電極和毛細(xì)管的入口端,以防止酶和底物溶液相互污染。電泳條件為:毛細(xì)管總長度60.2 cm(有效柱長50 cm,內(nèi)徑75 μm),柱溫25 ℃,檢測波長214 nm, PBS緩沖體系(pH 8.0, 20 mmol/L),電壓-15 kV。通過測量產(chǎn)物的電泳峰面積來測定天麻素對AChE活性的抑制情況。

1.6 AChE微反應(yīng)器的再生

當(dāng)固定化酶微反應(yīng)器的活性變差后,可以將毛細(xì)管柱用1 mol/L NaCl、0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH依次沖洗,以洗脫掉固定在柱上的AChE,然后重復(fù)酶的固定化制備方案。

2 結(jié)果與討論

2.1 毛細(xì)管內(nèi)壁改性方案分析

熔融石英毛細(xì)管的內(nèi)表面由于硅烷醇基團(tuán)的電離而帶有負(fù)電荷,AChE也帶有負(fù)電荷。因此,必須通過具有強(qiáng)陽離子基團(tuán)的水溶性電解質(zhì)或聚合物來改性毛細(xì)管壁內(nèi)壁,使其附著上正電荷,以制備固定化酶微反應(yīng)器(見圖1)。本研究采用0.1% HBD溶液進(jìn)行內(nèi)壁改性。

圖 1 毛細(xì)管柱酶反應(yīng)器制備原理圖Fig. 1 Schematic of the micro-enzyme reactor development in capillary columnAChE: acetylcholinesterase.

實驗結(jié)果表明,HBD改性得到的正電荷涂層足夠穩(wěn)定,可以承受運(yùn)行緩沖液的多次沖洗。此外,帶正電荷的涂層可以產(chǎn)生恒定的反向電滲流,可加速帶負(fù)電荷分析物的遷移速度,實現(xiàn)更為快速的分離;涂層前后中性標(biāo)記物N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的出峰時間由5 min延長至10 min,可知毛細(xì)管內(nèi)壁正電荷改性成功。

2.2 實驗條件的優(yōu)化

2.2.1底物進(jìn)樣時間的考察

采用壓力進(jìn)樣法(0.015 MPa)將底物注入酶反應(yīng)器,結(jié)果顯示,底物(10 mmol/L AThC )注入酶反應(yīng)器的時間不同會對產(chǎn)物的峰面積產(chǎn)生影響。由圖2a可知,當(dāng)進(jìn)樣時間從5 s延長到10 s時,反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積逐漸增加,并在10 s時達(dá)到最大,因此選擇10 s作為底物的進(jìn)樣時間。

圖 2 (a)底物進(jìn)樣時間和(b)反應(yīng)時間對產(chǎn)物峰面積的影響(n=5)Fig. 2 Effect of (a) substrate injection time and (b) reaction time on peak areas of products (n=5)

2.2.2底物與酶反應(yīng)器作用時間的考察

固定底物進(jìn)樣時間為10 s(0.015 MPa),考察底物與酶的反應(yīng)時間對產(chǎn)物峰面積的影響。結(jié)果顯示,反應(yīng)時間從0.5 min延長到3.0 min,產(chǎn)物的峰面積逐漸增加,并在1.0 min后達(dá)到最大;當(dāng)反應(yīng)時間大于1.0 min后,產(chǎn)物的峰面積呈下降趨勢(見圖2b)。故選擇1.0 min作為底物和酶的反應(yīng)時長。

2.3 固定化酶微反應(yīng)器的穩(wěn)定性考察

在上述微酶反應(yīng)器中,將不同濃度的天麻素重復(fù)進(jìn)樣10次,計算產(chǎn)物峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值。結(jié)果顯示,當(dāng)天麻素質(zhì)量濃度為0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mg/L時,產(chǎn)物峰面積的RSD分別為3.7%、4.0%、4.0%、5.3%、3.8%、3.6%和3.3%(n=10)。由結(jié)果可知,此固定化酶微反應(yīng)器有較好的重復(fù)性。每進(jìn)行100次試驗,檢測同一樣品,峰面積基本保持一致。由此可知,該酶微反應(yīng)器具有良好的活性,可持續(xù)運(yùn)行至少300次。

圖 3 (a)不同濃度天麻素對產(chǎn)物峰面積的影響及(b)抑制率擬合曲線(n=10)Fig. 3 (a) Effect of gastrodin concentration on peak areas of products and (b) the fitting curve of gastrodin inhibition rate (n=10) Concentration of gastrodin was 0, 0.87, 1.75, 2.62, 3.50, 4.37 and 5.24 μmol/L in the direction of arrow.

2.4 CE法測定天麻素對AChE活性抑制

在2 mL底物中分別添加0、0.87、1.75、2.62、3.50、4.37和5.24 μmol/L的天麻素10 μL,通過產(chǎn)物峰面積考察不同濃度的天麻素對AChE活性的抑制。結(jié)果表明:每次分離可在6 min內(nèi)完成,隨著天麻素濃度的增加,產(chǎn)物峰面積逐漸減小,對AChE的活性抑制越大(見圖3a),即對AChE活性的抑制率逐漸增加,當(dāng)天麻素濃度達(dá)到5.24 μmol/L時,抑制率達(dá)到64.8%。抑制率根據(jù)公式(1)[14,19]進(jìn)行計算。

(1)

2.5 紫外分光光度法測定天麻素對AChE的活性抑制

采用傳統(tǒng)紫外分光光度法,測定天麻素對AChE的IC50值:將2.65 mL PBS、50 μL AChE、100 μL DTNB和100 μL天麻素溶液混合,5 min后加入100 μL底物,10 min后加入1 mL 0.4% SDS終止反應(yīng),所得溶液在412 nm下測量吸光度并根據(jù)公式(2)計算抑制率[20],

(2)

3 結(jié)論

本研究基于離子吸附作用制備了固定化毛細(xì)管AChE微酶反應(yīng)器,得到該固定化微酶反應(yīng)器最適宜的工作條件為:底物的最優(yōu)進(jìn)樣時間10 s,酶與底物的最優(yōu)反應(yīng)時間1 min。結(jié)合CE法在線研究了固定化AChE微酶反應(yīng)器的性能,成功測定出天麻素對AChE的IC50值為(2.26±0.14) μmol/L。與紫外分光光度法相比較,CE法簡單、高效、成本低,由儀器自動完成的固定化AChE酶反應(yīng)器制備過程簡單快速,穩(wěn)定性較好,可重復(fù)使用,極大地提高了工作效率,未來有望應(yīng)用于各類AChEI的高通量篩選,對阿爾茲海默癥的治療將產(chǎn)生積極的影響。