王姣 劉蜀蓉 龔玉萍

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)是臨床最常見的非霍奇金淋巴瘤(non Hodgkin lymphoma，NHL)，目前其發(fā)病率在各年齡段均呈上升趨勢(shì)。由于DLBCL在免疫表型、生物學(xué)特性、預(yù)后等方面具有較大異質(zhì)性，因此探討新的分子標(biāo)記物對(duì)DLBCL進(jìn)行準(zhǔn)確的臨床分型，及提示預(yù)后方面具有重要意義。微小RNA-103(MicroRNA-103，miR-103)參與調(diào)控各種生物學(xué)功能過程，其在多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[1]。而軸抑制因子2(Axis inhibitor 2，AXIN2)異常表達(dá)可影響細(xì)胞正常生長發(fā)育，與多種實(shí)體腫瘤發(fā)生及預(yù)后有關(guān)[2]。已有研究報(bào)道，miR-103、AXIN2與多種疾病發(fā)展進(jìn)程及不良預(yù)后關(guān)系密切[3,4]，而與DLBCL的關(guān)系尚不明確。鑒于此，本研究通過檢測(cè)DLBCL組織中miR-103、AXIN2表達(dá)，并分析其與DLBCL患者臨床特征、分型及預(yù)后關(guān)系。報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年1月至2013年12月在本院接受手術(shù)治療的彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)患者110例作為受試對(duì)象，將術(shù)中切除腫瘤組織分為兩部分，一部分常規(guī)石蠟包埋，另一部分保存于-80℃低溫環(huán)境中。110例DLBCL患者男62例，女48例；年齡20～75歲，平均年齡(58.79±15.02)歲；Ann Arbor分期：Ⅰ期27例，Ⅱ期38例，Ⅲ期25例，Ⅳ20例；淋巴瘤國際預(yù)后指數(shù)(IPI)評(píng)分：低危組(0～2)分50例，高危組(3～5)分60例；血清乳酸脫氫酶(LDH)水平<245 U/L 47例，LDH水平≥245 U/L 63例；血β2微球蛋白(β2-MG)水平<3 mg/L 59例，β2-MG水平≥3 mg/L 51例。另選取同期行手術(shù)治療的85例淋巴結(jié)反應(yīng)性增生患者作為對(duì)照組，男49例，女36例；年齡21～74歲，平均年齡(57.46±14.93)歲。所有受試者知情同意，簽署知情同意書。本研究經(jīng)四川大學(xué)華西醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。2組患者一般資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 入選與排除標(biāo)準(zhǔn) 入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)均符合DLBCL診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；(2)術(shù)前均未接受放、化療；(3)術(shù)中切除組織均可用；(4)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴有其他血液系統(tǒng)疾?。?2)存在溝通障礙；(3)女性妊娠或哺乳期；(4)存在嚴(yán)重肝、腎功能障礙。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化EnVision兩步法檢測(cè)蛋白表達(dá)：采用免疫組化EnVision兩步法檢測(cè)110例DLBCL組織中CD10、BCL-6、MUM1、AXIN2蛋白表達(dá)。CD10、BCL-6、MUM1即用型抗體均購自上海信裕生物科技有限公司，兔AXIN2多克隆抗體購自北京百諾威生物科技有限公司。結(jié)果判定：CD10、BCL-6、MUM1、AXIN2均定位于胞核，隨機(jī)選取每張切片5個(gè)高倍視野(400×)，由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富醫(yī)師共同統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞染色情況。陰性(-)：無陽性細(xì)胞染色或陽性細(xì)胞染色≤10%；陽性(+)：陽性細(xì)胞染色>10%。根據(jù)CD10、BCL-6、MUM1染色結(jié)果，并結(jié)合Hans分類標(biāo)準(zhǔn)[6]：110例患者中生發(fā)中心B細(xì)胞樣(germinal center B-cell-like，GCB)型52例，非生發(fā)中心B細(xì)胞樣(non-germinal center B-cell-like，non-GCB)型58例。

1.3.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-103、AXIN2 mRNA水平：采用實(shí)時(shí)定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)檢測(cè)組織中miR-103、AXIN2 mRNA表達(dá)水平。按照Trizol法提取DLBCL組織中總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，miR-103內(nèi)參為U6、AXIN2 mRNA內(nèi)參為GAPDH。反應(yīng)條件為：95℃，預(yù)變性30 s；95℃，變性10 s；65℃，退火10 s；72℃，延伸15 s；合計(jì)40個(gè)循環(huán)，完成后觀察擴(kuò)增產(chǎn)物特異性。重復(fù)3次后整理數(shù)據(jù)，采用2-ΔΔCt計(jì)算miR-103、AXIN2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。本研究以miR-103、AXIN2 mRNA相對(duì)表達(dá)量<均值者為低表達(dá)，≥均值者為高表達(dá)。引物序列均由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 隨訪：110例DLBCL患者出院后，由專人以電話形式進(jìn)行隨訪，隨訪日期截至2018年12月31日，隨訪期間記錄患者生存、死亡情況，死亡患者以最后1次隨訪日期作為截止日期，隨訪結(jié)束后統(tǒng)計(jì)5年總體生存率(OS)。

2 結(jié)果

2.1 DLBCL組織中AXIN2蛋白表達(dá) DLBCL組織中AXIN2蛋白陽性表達(dá)26例(23.64%，26/110)，其中8例(30.77%，8/26)為GCB型，18例(69.23%，18/26)為non-GCB型，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 DLBCL組織中AXIN2蛋白表達(dá)情況(En Vision兩步法染色×400);A DLBCL組織中AXIN2陰性表達(dá)；B GCB型DLBCL組織中AXIN2陽性表達(dá)；C non-GCB型DLBCL組織中AXIN2陽性表達(dá)

2.2 不同組織中miR-103、AXIN2 mRNA表達(dá)水平比較 DLBCL組織miR-103表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組淋巴結(jié)組織(P<0.05)，AXIN2 mRNA表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組淋巴結(jié)組織(P<0.05)。見表2。

表2 不同組織中miR-103、AXIN2 mRNA表達(dá)水平比較

2.3 DLBCL組織miR-103、AXIN2 mRNA表達(dá)與臨床特征關(guān)系 miR-103表達(dá)與年齡、性別及β2-MG水平無關(guān)(P>0.05)，與DLBCL患者Ann Arbor分期、IPI評(píng)分、LDH水平及Hans分型有關(guān)(P<0.05)；AXIN2 mRNA表達(dá)與年齡、性別及LDH、β2-MG水平無關(guān)(P>0.05)，與DLBCL患者Ann Arbor分期、IPI評(píng)分、Hans分型有關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 DLBCL組織miR-103、AXIN2 mRNA表達(dá)與臨床特征關(guān)系 例

2.4 DLBCL組織miR-103與AXIN2 mRNA表達(dá)相關(guān)性 DLBCL組織miR-103與AXIN2 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.515，P<0.05)。見圖2。

圖2 DLBCL組織miR-103與AXIN2 mRNA表達(dá)的相關(guān)性

2.5 miR-103與AXIN2 mRNA表達(dá)與DLBCL患者5年OS關(guān)系 110例DLBCL患者5年OS為53.64%(59/110)。miR-103低表達(dá)患者5年OS(64.91%)顯著高于高表達(dá)患者(41.51%)(P<0.05)；AXIN2 mRNA高表達(dá)患者5年OS(65.57%)明顯高于低表達(dá)患者(38.78%)(P<0.05)。見圖3。

圖3 miR-103與AXIN2 mRNA表達(dá)與DLBCL患者OS關(guān)系

2.6 影響DLBCL患者預(yù)后的因素分析 COX回歸單因素分析可知，Ann Arbor分期、IPI評(píng)分、Hans分型、miR-103及AXIN2 mRNA表達(dá)是影響DLBCL患者預(yù)后的不良因素(P<0.05)。進(jìn)一步多因素分析可知，Hans分型、miR-103及AXIN2 mRNA表達(dá)均是影響DLBCL患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表4。

表4 COX回歸分析影響DLBCL患者預(yù)后的因素

3 討論

DLBCL發(fā)病原因與免疫功能異常、細(xì)菌感染等因素有關(guān)，是一種多基因參與的復(fù)雜過程。目前，雖然部分DLBCL患者通過治療可痊愈，但多數(shù)患者治愈后復(fù)發(fā)率高，且復(fù)發(fā)后死亡率較高，這可能與DLBCL本身具有很強(qiáng)異質(zhì)性有關(guān)。因此，應(yīng)繼續(xù)尋找與DLBCL發(fā)生、發(fā)展相關(guān)因子，以提高患者遠(yuǎn)期生存率。既往研究報(bào)道，miR-103、AXIN2異常表達(dá)與肺癌、結(jié)腸癌等多種疾病臨床病理參數(shù)及預(yù)后有關(guān)[7,8]，因此有望成為治療及評(píng)估DLBCL患者預(yù)后的新靶點(diǎn)。

miRNA是一類內(nèi)源性非編碼RNA，在細(xì)胞分化及腫瘤發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色。有研究發(fā)現(xiàn)淋巴瘤中miRNA異常表達(dá)比其他腫瘤更為明顯[9]，這提示miRNA與淋巴瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，因此研究DLBCL中miR-103表達(dá)具有臨床意義。miR-103是miRNA中重要一員，首先發(fā)現(xiàn)于人宮頸癌HeLa細(xì)胞系中，其廣泛存在于人類多種腫瘤組織中，且表達(dá)穩(wěn)定[10]。Ke等[11]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸直腸癌患者miR-103表達(dá)上調(diào)，miR-103異常表達(dá)與細(xì)胞增殖、遷移有關(guān)。Zheng等[12]研究報(bào)道，miR-103在胃癌組織中高表達(dá)，其過表達(dá)與胃癌患者腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且生存分析結(jié)果顯示miR-103高表達(dá)者總生存率較低。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DLBCL組織miR-103表達(dá)水平遠(yuǎn)高于對(duì)照組淋巴結(jié)組織，與Ke等[11,12]研究結(jié)果相似，提示miR-103可能與DLBCL發(fā)生、發(fā)展有關(guān)；且miR-103與DLBCL患者Ann Arbor分期、IPI評(píng)分、LDH水平及Hans分型有關(guān)，進(jìn)一步提示miR-103異常表達(dá)可能參與DLBCL發(fā)展進(jìn)程。

AXIN是一類多功能構(gòu)架蛋白，其在胚胎發(fā)育過程中可影響體軸形成，并與某些腫瘤的病情進(jìn)展有關(guān)。AXIN2又稱Conductin或Axil，位于人染色體17q23-24。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，AXIN2異常表達(dá)與多種腫瘤的生物學(xué)特性及患者遠(yuǎn)期生存率有關(guān)[13,14]，因此研究AXIN2在DLBCL中表達(dá)對(duì)提示預(yù)后具有重要意義。Hu等[15]研究報(bào)道，前列腺癌組織中AXIN2低表達(dá)與患者腫瘤生長及術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)，提示檢測(cè)AXIN2表達(dá)可為前列腺癌患者臨床治療及預(yù)后提供幫助。本研究中，DLBCL組織中AXIN2蛋白陽性表達(dá)率為23.64%，non-GCB型明顯高于GCB型，且DLBCL組織AXIN2 mRNA表達(dá)水平遠(yuǎn)低于對(duì)照組淋巴結(jié)組織，提示AXIN2可能與DLBCL發(fā)生及臨床分型有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，AXIN2 mRNA表達(dá)與DLBCL患者Ann Arbor分期、IPI評(píng)分、Hans分型有關(guān)，與Hu等[15]研究類似，提示AXIN2可能在DLBCL發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色。本研究還發(fā)現(xiàn)，DLBCL組織miR-103與AXIN2 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與Chen等[16]報(bào)道m(xù)icroRNA-544可通過調(diào)控AXIN2表達(dá)促進(jìn)人骨肉瘤細(xì)胞增殖相似，推測(cè)miR-103可能靶向調(diào)控AXIN2表達(dá)。生存分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-103低表達(dá)者、AXIN2 mRNA高表達(dá)者5年OS較高，提示miR-103、AXIN2異常表達(dá)可能與DLBCL患者遠(yuǎn)期生存、死亡情況有關(guān)；且二者表達(dá)均可獨(dú)立影響DLBCL患者預(yù)后情況，進(jìn)一步提示miR-103、AXIN2表達(dá)可作為DLBCL患者預(yù)后評(píng)估的重要分子標(biāo)記物。

綜上所述，DLBCL組織中miR-103表達(dá)上調(diào)、AXIN2表達(dá)下調(diào)，其異常表達(dá)與DLBCL患者Ann Arbor分期、Hans分型等臨床特征及預(yù)后有關(guān)，可作為臨床治療DLBCL及評(píng)估預(yù)后的新靶點(diǎn)。本研究未分析淋巴結(jié)反應(yīng)性增生患者術(shù)后5年OS，且miR-103、AXIN2兩因子間相互作用對(duì)DLBCL發(fā)生、發(fā)展的影響未深入探討，接下來應(yīng)加大樣本量繼續(xù)研究。