姚宇 王文軍 梁玉靈

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一種慢性的、進(jìn)展的以進(jìn)行性呼吸困難為主要臨床表現(xiàn)的纖維性間質(zhì)性肺疾病[1]。羥甲基戊二酰輔酶A還原酶降解蛋白1(Hmg-CoA reductase degradation protein 1,Hrd1),又名synoviolin，是一種E3泛素連接酶，它廣泛的參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解途徑，具有抑制Nrf2的表達(dá)、促進(jìn)Ⅰ型膠原成熟與分泌的作用[2-4]。Ⅰ型膠原是肺組織發(fā)生纖維化的主要膠原纖維之一，構(gòu)成了細(xì)胞外基質(zhì)[5]。Nrf2則是機(jī)體抗氧化反應(yīng)的重要分子，其含量的降低而引起整個(gè)氧化/抗氧化反應(yīng)的失衡是肺纖維化的發(fā)病機(jī)制之一[6]。因此Hrd1可能在肺纖維化炎癥期及纖維化期同時(shí)起作用并成為潛在的治療靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)利用LS-102干預(yù)大鼠肺纖維化模型，檢測(cè)Hrd1的表達(dá)及其與Ⅰ型膠原、Nrf2的關(guān)系以初步探究其在肺纖維化中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級(jí)SD雄性大鼠60只，6～8周齡，體重(230±40)g，由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(川)2018-17。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查(受理號(hào)20181221002)。注射用鹽酸博來(lái)霉素(浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)17001711)。兔抗大鼠Hrd1、Nrf2多克隆抗體(ProteinTech中國(guó)分公司),兔抗大鼠Ⅰ型膠原、TGF-β1多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，LS-102(美國(guó)Merckmillipore公司),DMSO溶液(美國(guó)Sigma公司)，HE、Masson染色試劑(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)。病理圖文分析系統(tǒng)(Olympus)。

1.2 動(dòng)物模型的制備、處理及分組 將60只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組、溶劑組、LS-102組，每組15只。用2%戊巴比妥鈉麻醉后，除對(duì)照組外緩慢注射博來(lái)霉素溶液(5 mg/kg)制備肺纖維化模型，對(duì)照組氣管內(nèi)注射等體積0.9%氯化鈉溶液，LS-102組根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，于造模后予以腹腔注射LS-102溶液(1 mg/kg)，溶劑組、對(duì)照組和模型組同時(shí)予以腹腔注射等體積DMSO溶液、0.9%氯化鈉溶液。各組于實(shí)驗(yàn)后每日腹腔注射等體積上述藥物至大鼠被處死。分別于造模后第7天、第14天、第28天每組隨機(jī)各處死5只大鼠。

1.3 肺系數(shù)的計(jì)算 4組大鼠處死前稱重，取肺組織后鈍性分離周?chē)M織及血凝塊后，予以0.9%氯化鈉溶液沖洗至組織變白，用紗布輕柔地吸干水分，稱肺濕重，以公式計(jì)算肺系數(shù)：肺濕重(g)/動(dòng)物重量(g)×100。

1.4 肺組織病理學(xué)變化 4組大鼠肺組織于10%中性甲醛固定24 h后，予以石蠟包埋切片并行HE染色、Masson染色。運(yùn)用ImagePro-Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，HE染色選取炎性最明顯的5個(gè)中倍鏡視野(×200)計(jì)算炎性細(xì)胞的數(shù)量(盡量避開(kāi)大血管、大氣管)。Masson染色顯示膠原纖維為藍(lán)色，細(xì)胞核為藍(lán)墨色，肌纖維、紅細(xì)胞為紅色，測(cè)定陽(yáng)性區(qū)域的累積光密度(IOD)。計(jì)算每組炎性細(xì)胞數(shù)量的平均值及膠原纖維累積光密度(IOD)的平均值。

1.5 免疫組化檢測(cè) 采用ELPS法檢測(cè)各組大鼠肺組織Hrd1、Ⅰ型膠原、Nrf2的表達(dá)量。取大鼠肺組織固定后進(jìn)行石蠟包埋并切片。按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，主要步驟為脫蠟、水化，滅活內(nèi)源過(guò)氧化物酶、漂洗、抗原修復(fù)，加一抗(1∶100)4℃過(guò)夜、沖洗后加入二抗，蘇木素復(fù)染后脫水、干燥封片。以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色染色為陽(yáng)性反應(yīng)，顏色越深則表達(dá)越強(qiáng)。每個(gè)切片取隨機(jī)取5個(gè)高倍鏡陽(yáng)性表達(dá)視野(×400)，利用ImagePro-Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)定各目標(biāo)蛋白陽(yáng)性細(xì)胞的累積吸光度值(IOD值)及相應(yīng)面積(Area)，計(jì)算平均吸光度值(MOD=IOD/Area)分別作為Hrd1、Ⅰ型膠原、Nrf2表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺系數(shù) 模型組大鼠在第7、14、28天肺系數(shù)均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中LS-102組在第14、28天肺系數(shù)均低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。見(jiàn)表1。

表1 4組大鼠各時(shí)間點(diǎn)肺系數(shù)變化

2.2 4組肺組織病理學(xué)變化

2.2.1 肺組織肉眼觀察:第7、14、28天對(duì)照組處死大鼠肺組織呈粉紅色、組織彈性良好、表面光滑。第7天其余3組多于肺上葉可見(jiàn)大量暗紅色片狀出血，肺組織腫脹明顯、重量增加。第14天，模型、溶劑組、LS-102組大鼠肺組織仍有少許片狀出血灶，上葉肺組織出現(xiàn)皺縮，可見(jiàn)少量結(jié)節(jié)。第28天，模型、溶劑組肺組織顏色稍蒼白、質(zhì)地較硬，上葉肺組織皺縮明顯，表面凹凸不平，下葉可見(jiàn)輕度肺組織皺縮、少量結(jié)節(jié)。

2.2.2 光鏡下:光鏡觀察下，對(duì)照組大鼠各時(shí)間點(diǎn)肺泡結(jié)構(gòu)完整，均未見(jiàn)明顯炎性及纖維化表現(xiàn)，偶見(jiàn)大鼠肺泡周?chē)梢?jiàn)少許炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組與溶劑組肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺間質(zhì)周?chē)梢?jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，隨時(shí)間逐漸消退，均仍高于對(duì)照組。LS-102組大鼠肺組織僅第7天炎性細(xì)胞浸潤(rùn)少于上述2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組與溶劑組肺組織在第14天出現(xiàn)較多膠原纖維沉積，逐漸增高，均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LS-102組第14天、28天膠原纖維沉積少于上述2組(P<0.05)。見(jiàn)圖1、2，表2、3。

圖1 4組大鼠肺組織HE染色動(dòng)態(tài)變化(Masson×200)

圖2 4組大鼠肺組織Masson染色動(dòng)態(tài)變化(Masson×200)

表2 4組大鼠肺組織炎性細(xì)胞數(shù)量比較

表3 4組大鼠肺組織膠原纖維IOD比較

2.3 大鼠肺組織免疫組化

2.3.1 肺組織中Hrd1的表達(dá):與模型組及溶劑組相比，所有時(shí)間點(diǎn)LS-102組中Hrd1表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組第7天Hrd1表達(dá)達(dá)到峰值，以后逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4，圖3。

表4 4組大鼠肺組織Hrd1 MOD比較

圖3 4組大鼠肺組織Hrd1免疫組化動(dòng)態(tài)變化(IHC×400)

2.3.2 肺組織中Nrf2的表達(dá):與模型組及溶劑組比較，第7天LS-102組中Nrf2表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組第7天Nrf2表達(dá)達(dá)到峰值，以后逐漸降低。見(jiàn)圖4，表5。

圖4 4組大鼠肺組織Nrf2免疫組化動(dòng)態(tài)變化(IHC×400)

表5 4組大鼠肺組織Nrf2 MOD比較

2.3.3 肺組織中Ⅰ型膠原的表達(dá):與模型組及溶劑組比較，第14天、28天LS-102組中Ⅰ型膠原表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組Ⅰ型膠原的表達(dá)在第14天明顯增加，在第28天達(dá)到高峰。見(jiàn)圖5，表6。

圖5 4組大鼠肺組織Ⅰ型膠原免疫組化動(dòng)態(tài)變化(IHC×400)

表6 4組大鼠肺組織Ⅰ型膠原 MOD比較

3 討論

特發(fā)性肺纖維化是慢性進(jìn)展性致纖維化性的間質(zhì)性肺炎的一種特殊類型，其準(zhǔn)確的發(fā)病機(jī)制仍然不清楚[1]，預(yù)后極差。其整個(gè)發(fā)病過(guò)程可以大致分為炎癥期和纖維化期。通過(guò)抑制介導(dǎo)兩個(gè)時(shí)期的分子信號(hào)通路有望獲得有效的治療方法。Hrd1,是一種E3泛素連接酶，主要參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白降解?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)它可作為IRE1-XPB1信號(hào)通路的下游效應(yīng)物參與未折疊蛋白反應(yīng)而調(diào)控Nrf2、參與膠原的合成與成熟，參與了肝纖維化/肝硬化、腎纖維化的發(fā)病[2,3]。另有研究表明Hrd1通過(guò)調(diào)節(jié)Ⅰ型膠原的表達(dá)和成熟參與了外顯顯子-4缺陷的肺表面蛋白C所致的間質(zhì)性肺炎(家族性間質(zhì)性肺炎)的發(fā)病[4]。Nrf2是肺纖維化中早期炎癥期的重要保護(hù)因子[5]，Ⅰ型膠原是纖維化期的主要組分之一[6]。LS-102是Yagishita等[7,8]研究發(fā)現(xiàn)的Hrd1的高選擇性抑制劑。本研究在現(xiàn)有報(bào)道的基礎(chǔ)下，利用LS-102進(jìn)一步探討Hrd1在博來(lái)霉素所致大鼠肺纖維化的作用。

本研究表明大鼠肺組織Hrd1的表達(dá)，在早期肺泡炎癥階段最高，以后逐漸下降，可能Hrd1主要參與大鼠肺纖維化炎癥階段有關(guān)。抑制Hrd1后，Nrf2表達(dá)增加，在肺泡炎階段(第7天)最明顯。與Wu等[3]研究結(jié)果相似。推測(cè)主要是因?yàn)镠rd1可能主要抑制早期炎癥階段的Nrf2表達(dá)，而后期Nrf2升高不明顯，可能肺纖維化過(guò)程中同時(shí)通過(guò)調(diào)節(jié)Nrf2-Keap1等其他炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)通路抑制了Nrf2的生成。

既往研究發(fā)現(xiàn)Hrd1能參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的未折疊蛋白反應(yīng)，有降解未折疊蛋白的作用，進(jìn)而起到細(xì)胞保護(hù)作用，并且Hrd1是未折疊蛋白反應(yīng)的三條主要通路之一的IRE1-XBP1的下游效應(yīng)物[9]。有研究證實(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其引起的未折疊蛋白反應(yīng)是廣泛參與了肺纖維化的發(fā)病過(guò)程[10]。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，可能為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與肺纖維化的具體機(jī)制進(jìn)行了一定的補(bǔ)充。氧化應(yīng)激反應(yīng)被證實(shí)參與肺纖維化的炎癥期發(fā)病過(guò)程[11]，而Nrf2相關(guān)通路是機(jī)體抗氧化通路中核心通路的，能對(duì)多種抗氧化因子產(chǎn)生促進(jìn)作用[12]，而本研究結(jié)果提示Hrd1可能通過(guò)早期抑制Nrf2介導(dǎo)的抗氧化通路而參與肺纖維化的發(fā)病。

本研究中，抑制Hrd1后，Ⅰ型膠原在第14、28天表達(dá)量明顯減少，提示Hrd1可能抑制促進(jìn)Ⅰ型膠原的表達(dá)，與Li等[2]研究結(jié)果相近?？赡芘c直接促進(jìn)其分

泌及成熟有關(guān)[4]，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。多項(xiàng)研究證實(shí)以Ⅰ型膠原等為主的細(xì)胞外基質(zhì)的沉積是在肺纖維化進(jìn)程中起主要作用[6]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Hrd1可能有促進(jìn)Ⅰ型膠原表達(dá)而參與IPF發(fā)病過(guò)程。

我們的研究表明，博來(lái)霉素致肺纖維化大鼠肺組織中Hrd1大量表達(dá)，抑制Hrd1能減少Ⅰ型膠原的表達(dá)，增加Nrf2的早期表達(dá)。表明Hrd1可能通過(guò)促進(jìn)Ⅰ型膠原表達(dá)及抑制Nrf2的生成參與肺纖維化的發(fā)生發(fā)展，通過(guò)抑制Hrd1能減少纖維化期Ⅰ型膠原的沉積和增加炎癥期Nrf2的表達(dá)以激活體內(nèi)抗氧化通路，可能為抗肺纖維化藥物的研制提供新的靶點(diǎn)。