孫偉力 康天 孫建平 王苑宇 孫曉楓 楊悅 焦保華

腦膠質(zhì)瘤是起源于神經(jīng)上皮的腫瘤的統(tǒng)稱，年發(fā)病率為(3～8)/10萬(wàn)。和其他腫瘤一樣，膠質(zhì)瘤的發(fā)病也是由于遺傳易感因素和環(huán)境中的多種致癌因素相互作用的結(jié)果。越來(lái)越多的研究表明：在多種腫瘤中出現(xiàn)的非編碼RNA的表達(dá)失調(diào)，可能參與了調(diào)控腫瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程[1]。近年來(lái)，研究者對(duì)LncRNA和microRNA在膠質(zhì)瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的作用進(jìn)行了大量研究。有報(bào)道證實(shí)LncRNA TUG1在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)下調(diào)，可發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用，TUG1在體外過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，這提示TUG1可能是治療膠質(zhì)瘤的潛在治療靶點(diǎn)[2]。另?yè)?jù)報(bào)道，在膠質(zhì)瘤組織中LncRNA H19的過(guò)表達(dá)與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，沉默H19可以通過(guò)調(diào)節(jié)miR-675的表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[3]。OIP5-AS1是從編碼OIP5的同一基因的反義方向轉(zhuǎn)錄的，最初在斑馬魚(yú)中被稱為cyrano，發(fā)現(xiàn)其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的早期發(fā)育中起關(guān)鍵作用[4]。在膠質(zhì)瘤的發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程中，OIP5-AS1是否存在調(diào)節(jié)作用，目前筆者尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)研究。已有研究報(bào)道：miR-410的表達(dá)量隨膠質(zhì)瘤級(jí)別的升高而降低，可以靶向作用于下游抑癌基因MET，有效調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[5]。在本研究中，將探討OIP5-AS1和miR-410在腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)的差異性及與膠質(zhì)瘤惡性程度的關(guān)系，并進(jìn)一步探討二者相互作用的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016年10月至2017年10月在河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)切除的膠質(zhì)瘤患者標(biāo)本65例(膠質(zhì)瘤組)，所有患者術(shù)前未進(jìn)行其他治療，且不合并其他系統(tǒng)的原發(fā)性惡性腫瘤、嚴(yán)重全身感染以及結(jié)締組織疾病。收集同期10例行去骨瓣減壓術(shù)的重度顱腦外傷患者術(shù)中為降低顱內(nèi)壓，部分切除的腦組織標(biāo)本作為對(duì)照組。

1.2 儀器與試劑 Real-Time PCR System購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystem公司；Dual-Luciferase? Reporter Assay Syste購(gòu)自普洛麥格生物技術(shù)有限公司；BX51熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；Trizol試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；SYBR Premix Ex Tap Ⅱ、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；HEK 293T細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院；Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；質(zhì)粒由上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司合成。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)分組:根據(jù)標(biāo)本的性質(zhì)分為腫瘤組與非腫瘤對(duì)照組，根據(jù)WHO 2007年發(fā)表的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤病理分類將腫瘤組再分為2組：低級(jí)別膠質(zhì)瘤(Ⅰ/Ⅱ級(jí))組，高級(jí)別膠質(zhì)瘤(Ⅲ/Ⅳ級(jí))組。

1.3.2 設(shè)計(jì)及合成引物序列:通過(guò)NCBI，選擇目的基因/SNP位點(diǎn)，查找序列，設(shè)計(jì)引物，篩選引物，優(yōu)化各組分濃度，并經(jīng)BLAST檢查引物特異性。由生工生物工程(上海)公司合成上述引物。見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.3.3 Real-Time PCR反應(yīng)：采用Trizol試劑盒及氯仿、異丙醇、乙醇、DEPC等經(jīng)裂解、勻漿、離心、洗滌、溶解后從各組膠質(zhì)瘤組織、正常組織的細(xì)胞中提取總RNA。經(jīng)BioTek Synergy HT多功能酶標(biāo)儀鑒定待測(cè)樣品OD260/OD280的比值及其濃度。然后取總RNA(2 μg)在無(wú)RNA酶離心管中配置反應(yīng)體系在適當(dāng)條件下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒、引物、cDNA等配置總體積20 μl的qRT-PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：起始過(guò)程95℃ 10 min；擴(kuò)增過(guò)程95℃ 15 s，60℃ 1 min，總共擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增cDNA。并以U6作為miR-410的內(nèi)參基因，GAPDH作為OIP5-AS1的內(nèi)參基因。待測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算，其中-ΔΔCt=-(ΔCt腫瘤組-ΔCt對(duì)照組)，ΔCt腫瘤組=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔCt對(duì)照組=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次，取平均值。

1.3.4 生物信息學(xué)分析:在Starbase 2.0數(shù)據(jù)庫(kù)中，根據(jù)miR-410尋找調(diào)節(jié)其表達(dá)的LncRNA，初步明確是否為OIP5-AS1。進(jìn)一步使用Target Scan預(yù)測(cè)軟件，確定miR-410和OIP5-AS1的結(jié)合位點(diǎn)。

1.3.5 HEK 293T細(xì)胞的培養(yǎng)及傳代:①細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)：37℃水浴預(yù)熱含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，快速解凍HEK 293T細(xì)胞系、重懸細(xì)胞，然后于1 000 r/min離心5 min。棄上清，加5 ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，接種到25 cm2的培養(yǎng)瓶中，搖勻后在5% CO2孵箱中37℃恒溫培養(yǎng)。②細(xì)胞傳代：當(dāng)細(xì)胞融合度長(zhǎng)至約90%時(shí)，給細(xì)胞傳代。在超凈臺(tái)中棄培養(yǎng)基，加入5 ml PBS清洗細(xì)胞后，再加入1 ml 0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞。加入5 ml含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹下瓶壁上剩余的細(xì)胞，將細(xì)胞移入離心管中，1 000 r/min離心5 min。棄上清，重懸細(xì)胞后，接種到75 cm2培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞密度在1×104細(xì)胞/cm2，恒溫培養(yǎng)。并以1∶10傳代，提取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK 293T細(xì)胞用于雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。

1.3.6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn):①實(shí)驗(yàn)分組:將293T細(xì)胞分為NC組(轉(zhuǎn)染NC序列)和miR-410 mimics組(轉(zhuǎn)染miR-410模擬物)。②構(gòu)建質(zhì)粒:由上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司合成。③轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞質(zhì)粒:提取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK 293T細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到80%時(shí)，按照Lipofectamine-2000試劑盒說(shuō)明書(shū)分別轉(zhuǎn)染NC序列和miR-410模擬物序列。④雙熒光素酶檢測(cè) 轉(zhuǎn)染約48 h后，加入20 μl Luciferase Assay試劑，震蕩混勻后立即使用酶標(biāo)儀檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光酶熒光值，隨后加入20 μl Stop & Glo?試劑，震蕩混勻后靜置3 min后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)海腎熒光酶熒光值，計(jì)算螢火蟲(chóng)熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床信息及資料歸納 (1)根據(jù)標(biāo)本性質(zhì)分組：腫瘤組65例，其中男40例，女25例；平均年齡(46.23±12.58)歲。對(duì)照組10例，重度顱腦外傷患者。(2)根據(jù)膠質(zhì)瘤病理級(jí)別分組：低級(jí)別膠質(zhì)瘤組29例，其中Ⅰ級(jí)12例，Ⅱ級(jí)17例。高級(jí)別膠質(zhì)瘤組36例，其中Ⅲ級(jí)19例，Ⅳ級(jí)17例。見(jiàn)表2。

表2 5組OIP5-AS1和miR-410的表達(dá)

2.2 正常腦組織和膠質(zhì)瘤組織HE染色 與正常腦組織HE染色相比，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤由分化程度低、多形性明顯、胞核的非典型性突出、有絲分裂活躍的高度間變的膠質(zhì)細(xì)胞組成，腫瘤的細(xì)胞密度高；腫瘤中可見(jiàn)明顯的微血管增殖和壞死。見(jiàn)圖1。

正常腦組織 膠質(zhì)瘤組織(WHO Ⅳ級(jí))

2.3 對(duì)照組與腫瘤組OIP5-AS1和miR-410的表達(dá) 腫瘤組和對(duì)照組OIP5-AS1和miR-410的表達(dá)水平。與正常腦組織比較，膠質(zhì)瘤組織中OIP5-AS1的表達(dá)水平明顯升高，miR-410的表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表3，圖2。

表3 對(duì)照組與腫瘤組OIP5-AS1和miR-410的表達(dá)

圖2 OIP5-AS1和miR-410在膠質(zhì)瘤和正常組織中的相對(duì)表達(dá)(散點(diǎn)圖)

2.4 不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組OIP5-AS1和miR-410的表達(dá)水平 OIP5-AS1在高級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平顯著高于低級(jí)別膠質(zhì)瘤組織(P<0.05)。miR-410在高級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平顯著低于低級(jí)別膠質(zhì)瘤組織(P<0.05)。OIP5-AS1和miR-410的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤的病理分級(jí)顯著相關(guān)。見(jiàn)表4。

表4 不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組織OIP5-AS1和miR-410的表達(dá)

2.5 相關(guān)性分析結(jié)果 Pearson檢驗(yàn)示：OIP5-AS1表達(dá)與miR-410表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.64，P<0.001)。見(jiàn)圖3。

圖3 OIP5-AS1表達(dá)水平與miR-410的相關(guān)性分析

2.6 OIP5-AS1與miR-410的關(guān)系 使用Starbase 2.0在線預(yù)測(cè)：OIP5-AS1是調(diào)節(jié)miR-410的分子海綿。進(jìn)一步使用Target Scan預(yù)測(cè)軟件確定了miR-410和OIP5-AS1可能的結(jié)合位點(diǎn)。見(jiàn)圖4。

圖4 在線生物信息軟件預(yù)測(cè)miR-410和OIP5-AS1的結(jié)合位點(diǎn)

2.7 雙熒光素酶活性測(cè)定結(jié)果 與NC組比較，miR-410 mimics對(duì)突變型OIP5-AS1-mt熒光素酶活性的影響無(wú)顯著差異；miR-410 mimics顯著下調(diào)野生型OIP5-AS1-wt的熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)：OIP5-AS1與miR-410之間存在靶向關(guān)系。見(jiàn)表5。

表5 雙熒光素酶活性測(cè)定結(jié)果

3 討論

膠質(zhì)瘤是發(fā)病率最高的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，2007年世界衛(wèi)生組織(WHO)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類將腦膠質(zhì)瘤分為Ⅰ～Ⅳ級(jí)，其中Ⅰ、Ⅱ級(jí)為低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤，Ⅲ、Ⅳ級(jí)為高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤。在本實(shí)驗(yàn)中，將此作為腫瘤組的分組標(biāo)準(zhǔn)，并進(jìn)一步檢測(cè)了OIP5-AS1和miR-410在各組中的表達(dá)，通過(guò)觀察這兩種非編碼RNA在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中表達(dá)的變化趨勢(shì)并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)證實(shí)二者與腫瘤惡性程度相關(guān)。

已有研究表明，與OIP5-AS1編碼同一基因的正義方向轉(zhuǎn)錄的OIP5在正常組織呈限制性表達(dá)，但在腎癌及乳腺癌等許多腫瘤中過(guò)表達(dá)，因此被認(rèn)為是一種致瘤基因，并且有可能成為靶向藥物治療的靶點(diǎn)[6]。目前筆者尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)研究表明編碼OIP5的同一基因的反義方向轉(zhuǎn)錄的OIP5-AS1在膠質(zhì)瘤發(fā)生及發(fā)展中的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，OIP5-AS1在哺乳動(dòng)物中普遍存在，在人類某些腫瘤中明顯高表達(dá)[7]。OIP5-AS1在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)水平較高，且在發(fā)育過(guò)程中對(duì)調(diào)控神經(jīng)發(fā)育起著非常重要的作用。同時(shí)，OIP5-AS1也是近年來(lái)腫瘤相關(guān)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。Kim等[8]的研究表明：在人宮頸癌Hela細(xì)胞中，OIP5-AS1可能作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA與RNA結(jié)合蛋白HuR結(jié)合并使其穩(wěn)定，從而抑制HuR誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，參與腫瘤細(xì)胞的調(diào)控。同樣，Deng等[9]研究報(bào)道，熒光素酶檢測(cè)證實(shí)miR-448是OIP5-AS1的靶基因，OIP5-AS1通過(guò)與miR-448競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，正向調(diào)控下游靶基因Bcl-2，在肺腺癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)時(shí)，發(fā)揮致癌作用，主要是影響肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。Yang等[10]還發(fā)現(xiàn)，在多發(fā)性骨髓瘤中OIP5-AS1通過(guò)調(diào)節(jié)miR-410的表達(dá)，調(diào)控其靶基因KLF10，從而介導(dǎo)PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期的進(jìn)展和抑制細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)明確了OIP5-AS1和miR-410的靶向調(diào)節(jié)關(guān)系。

在膠質(zhì)瘤組織中，OIP5-AS1表達(dá)顯著升高，而miR-410表達(dá)降低，提示OIP5-AS1與miR-410表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，經(jīng)Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)也已證實(shí)二者表達(dá)量變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此外，miR-410在人膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)下調(diào)，通過(guò)下調(diào)其靶基因MET，發(fā)揮抑癌作用，對(duì)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯抑制作用[5]。因此，我們假設(shè)OIP5-AS1可能發(fā)揮致癌基因的作用，miR-410可能作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的抑癌基因調(diào)節(jié)某些抑癌蛋白的表達(dá)并進(jìn)一步抑制腫瘤發(fā)生和/或進(jìn)展。本研究還發(fā)現(xiàn)OIP5-AS1和miR-410的表達(dá)與膠質(zhì)瘤的病理分級(jí)密切相關(guān)。其中，膠質(zhì)瘤患者病理分級(jí)越高，OIP5-AS1表達(dá)水平越高，miR-410表達(dá)水平越低，提示OIP5-AS1和miR-410與膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制和發(fā)展密切相關(guān)，可以推測(cè)OIP5-AS1對(duì)miR-410可能發(fā)揮“海綿分子”的功能。

Ganesan等[11]研究發(fā)現(xiàn)：OIP5-AS1過(guò)表達(dá)在人類上皮起源的腫瘤中很常見(jiàn)，OIP5-AS1在未分化細(xì)胞的口腔腫瘤中過(guò)表達(dá)，受其調(diào)節(jié)的6個(gè)miRNA(miR-137、miR-148a-3p、miR-30a-5p、miR-30b-5p、miR-338-3p和miR-22-3p)表達(dá)下調(diào)，OIP5-AS1對(duì)miRNA具有“海綿”的功能。OIP5-AS1表觀基因組分析結(jié)果表明，通過(guò)miR-143/145的重復(fù)表達(dá)，靶向干細(xì)胞特性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)共表達(dá)的NEAT1、TUG1和HOTAIR對(duì)OIP5-AS1進(jìn)行正向轉(zhuǎn)錄調(diào)控，可能是維持腫瘤細(xì)胞干細(xì)胞特點(diǎn)和低分化的原因，也是預(yù)后不良的原因。在膠質(zhì)瘤中，可能也存在這種調(diào)節(jié)機(jī)制，OIP5-AS1過(guò)表達(dá)，發(fā)揮其對(duì)miR-410的“海綿化”功能，并靶向抑制下游抑癌因子的表達(dá)，腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲力增強(qiáng)。同時(shí)，通過(guò)OIP5-AS1正向轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，表達(dá)不斷增強(qiáng)，進(jìn)一步加速腫瘤的增殖和侵襲，導(dǎo)致高級(jí)別的膠質(zhì)瘤中OIP5-AS1過(guò)表達(dá)。

本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)OIP5-AS1是膠質(zhì)瘤的促癌基因，通常情況下反義lncRNA可以負(fù)向調(diào)節(jié)對(duì)應(yīng)mRNA的表達(dá)，因此有必要了解OIP5在腫瘤發(fā)生中的作用，從而進(jìn)一步理解OIP5-AS1做為促癌基因的機(jī)制。Freitas等[12]發(fā)現(xiàn)OIP5在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)率較高，可達(dá)54%。同時(shí)OIP5陽(yáng)性表達(dá)組患者生存期比陰性組延長(zhǎng)25周，統(tǒng)計(jì)結(jié)果提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。我們可以從這一結(jié)果推斷OIP5在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤起到了抑制腫瘤進(jìn)展的作用。最近，Dorival等[13]在T98G GBM細(xì)胞系中對(duì)OIP5的敲除效果進(jìn)行了評(píng)估。結(jié)果表明，下調(diào)OIP5可以刺激膠質(zhì)瘤細(xì)胞的活力，抑制環(huán)己亞硝脲(抗癌藥)誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死和凋亡。OIP5在GBM細(xì)胞中的表達(dá)似乎能夠增強(qiáng)環(huán)己亞硝脲細(xì)胞毒性作用，進(jìn)一步證明該基因是GBM治療反應(yīng)的潛在治療靶點(diǎn)和可能的分子生物標(biāo)志物。但是國(guó)內(nèi)學(xué)者通過(guò)檢測(cè)92例膠質(zhì)瘤組織中OIP5的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)OIP5的陽(yáng)性表達(dá)率為18.47%，陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)[14]，能否作為膠質(zhì)瘤治療的新靶點(diǎn)需進(jìn)一步研究。OIP5在多數(shù)腫瘤中為促癌基因，而在GBM中則相反。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，新一代測(cè)序技術(shù)和DNA微陣列技術(shù)極大地幫助我們?cè)谌蚪M范圍內(nèi)識(shí)別不同癌癥及其亞型的miRNA和mRNA信號(hào)。通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miRNA在不同腫瘤中扮演著截然相反的角色。有研究發(fā)現(xiàn)：miR-410在兒童急性淋巴細(xì)胞白血病病例中的表達(dá)水平均明顯增高，在疾病進(jìn)展中起促進(jìn)作用，在體外實(shí)驗(yàn)得到進(jìn)一步證實(shí)[15]。miR-410在腫瘤中的作用與正、負(fù)調(diào)控相關(guān)：在某些腫瘤中負(fù)性調(diào)節(jié)BAK1、CETN3和BRD7促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲，在有些腫瘤中miR-410可以有效靶向c-MET、AGTR1和SNAIL等起到抑癌作用[16]。

雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)將含有目的DNA的序列插入到載體工具中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在轉(zhuǎn)錄水平測(cè)定上游刺激對(duì)下游靶基因的影響，可以快速、靈敏、高效地檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子和其靶啟動(dòng)子區(qū)DNA相互作用的關(guān)系，從而揭示細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的分子機(jī)制。

綜上所述，膠質(zhì)瘤組織中OIP5-AS1的表達(dá)水平明顯升高，miR-410的表達(dá)明顯降低，兩者可能影響膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展。OIP5-AS1和miR-410的表達(dá)與膠質(zhì)瘤的病理分級(jí)相關(guān)，而且OIP5-AS1表達(dá)與miR-410表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而且OIP5-AS1可以靶向調(diào)節(jié)miR-410的表達(dá)。為揭示膠質(zhì)瘤發(fā)生和侵襲性生長(zhǎng)的發(fā)病機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)，從而為膠質(zhì)瘤的基因治療和靶向治療提供了理論基礎(chǔ)。