張浪，劉亮亮，黃思齊，李德芳

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南長(zhǎng)沙410205）

黃麻（Corchorus capsularis L）屬錦葵科黃麻屬，一年生草本植物。黃麻可以作為蔬菜食用，有“帝王菜”之稱。研究［1］發(fā)現(xiàn)，黃麻葉中含有三萜、甾體、多酚、有機(jī)酸、生物堿和微量元素等物質(zhì)。文獻(xiàn)報(bào)道［2］食用黃麻葉有健脾胃、潤(rùn)腸通便、降血壓等諸多功效。因此，優(yōu)化黃麻葉中總多酚提取工藝及其抗氧化活性研究對(duì)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)黃麻產(chǎn)品具有促進(jìn)作用。中國(guó)種植黃麻歷史悠久，早在北宋《圖經(jīng)本草》（公元1061年）中就有黃麻形態(tài)的簡(jiǎn)要描述［3］。王群等［4］研究表明，黃麻纖維中抑菌的主要成分為三萜及甾體類。陳如冰等［5］采用超聲波法對(duì)長(zhǎng)朔黃麻中總黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)朔黃麻提取液對(duì)羥基自由基和超氧陰離子自由基有一定清除作用。羅玉芳等［6］研究超聲波輔助提取菜用黃麻色素的工藝條件，發(fā)現(xiàn)色素具有一定抗氧化作用和超氧自由基清除能力。黃麻葉中雖含有眾多有效成分，但目前對(duì)黃麻葉中多酚類化合物提取工藝及其抗氧化性研究鮮有報(bào)道。為此，本文以烘干菜用黃麻葉粉末為試驗(yàn)材料，采用響應(yīng)面法探究黃麻葉中總多酚提取最優(yōu)條件，考察反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃麻葉中總多酚提取量的影響，此外對(duì)黃麻提取液1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）和鐵離子還原/抗氧化能力（FRAP）抗氧化活性進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)所用“黃麻447號(hào)”為黃麻成熟期葉片，取樣于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所一年生團(tuán)隊(duì)海南基地，選取黃麻植株頂端向下1 m葉片為試驗(yàn)部分。80℃烘箱中充分烘干，粉碎得到黃麻葉粉末，供后續(xù)試驗(yàn)用。

“黃麻447號(hào)”基本指標(biāo)：粗蛋白質(zhì)含量20.4 g/100.0 g，粗纖維含量41.3 g/100.0 g，綠原酸含量 0.63 mg/kg，鈣 17.0 g/kg。

無(wú)水乙醇、七水合碳酸鈉、抗壞血酸（Vc）（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純），F(xiàn)olin-Ciocalteu’s試劑（上海麥克林生化科技有限公司，分析純），沒(méi)食子酸（源葉生物有限公司，分析純），DPPH測(cè)定抗氧化能力試劑盒、ABTS測(cè)定抗氧化試劑盒、FRAP測(cè)定抗氧化試劑盒（南京建成有限公司）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

UV-2700紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（島津企業(yè)管理有限公司），WEB-6多孔水浴鍋（上海皓莊儀器有限公司），F(xiàn)Zl02粉碎機(jī)（天津美斯特有限公司），KQ5200DV超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司），Allegra 64R高速冷凍離心機(jī)（北京萊伯泰科儀器股份有限公司），AL204-IC電子天平（梅特勒-托利多國(guó)際有限公司），GZX-9070鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅醫(yī)療設(shè)備廠），Kjeltec8400凱氏定氮儀（蘇州安創(chuàng)儀器有限公司），ICE3500 AA原子吸收光譜（上海智巖科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

黃麻葉中總多酚測(cè)定參考Carolina等［7］方法略有修改，配制濃度為1 mg/mL沒(méi)食子酸溶液，準(zhǔn)確移取120、150、180、210、240μL加入試管中，加超純水至2 mL，分別移取0.2 mL Folin-Ciocalteu’s和0.8 mL 10%的碳酸鈉溶液加入試管中，搖勻后黑暗環(huán)境中反應(yīng)1 h，765 nm處測(cè)定沒(méi)食子酸溶液OD值。

1.3.2 黃麻葉片提取液的制備及總多酚含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取黃麻葉粉末1.50 g于250 mL圓底燒瓶中，加入一定體積分?jǐn)?shù)乙醇，冷凝回流法提取。反應(yīng)結(jié)束后，將提取液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中4000 r/min離心3 min，將離心后上清液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，置于4℃冰箱備用。

根據(jù)1.3.1中方法測(cè)定黃麻葉片提取液吸光值，將其代入式（3）中計(jì)算得到黃麻提取液濃度C（mg/mL），三次試驗(yàn)取平均值。

式中：W—總多酚提取量，mg/g；

C—樣品濃度，mg/mL；

V—樣品定容體積，mL；

M—樣品質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

按照1.3.2中方法提取黃麻葉中總多酚，單因素及水平設(shè)定如下：

乙醇體積分?jǐn)?shù)：固定反應(yīng)條件為液料比30∶1（mL/g），反應(yīng)溫度90℃，反應(yīng)時(shí)間3.0 h?？疾觳煌掖俭w積分?jǐn)?shù)（30、40、50、60、70、80、90、100）對(duì)總多酚提取量的影響。

反應(yīng)時(shí)間：固定反應(yīng)條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，液料比30∶1（mL/g），反應(yīng)溫度90℃。檢測(cè)不同反應(yīng)時(shí)間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 h）對(duì)總多酚提取量的影響。

液料比：固定反應(yīng)條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，反應(yīng)時(shí)間2.5 h，反應(yīng)溫度90℃。考察不同液料比（10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1）（mL/g）對(duì)總多酚提取量的影響。

反應(yīng)溫度：固定反應(yīng)條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，反應(yīng)時(shí)間2.5 h，液料比30∶1（mL/g）?？疾觳煌磻?yīng)溫度（50、60、70、80、90、100℃）對(duì)總多酚提取量的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度為試驗(yàn)因素，黃麻總多酚提取量為響應(yīng)值，通過(guò)Box-Behnken［8］試驗(yàn)進(jìn)行四因素三水平的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels coding table of the response surface experiment

1.4 抗氧化活性試驗(yàn)

抗氧化活性試驗(yàn)采用三種不同的試劑進(jìn)行體外試驗(yàn)，包括2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽 （ABTS）［9］，鐵離子還原/抗氧化能力法（FRAP）［10］和 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）［11］。

1.4.1 DPPH自由基清除試驗(yàn)

取DPPH試劑1 mg溶于20 mL無(wú)水乙醇中，充分震蕩搖勻，配置成DPPH溶液。取DPPH溶液2 mL于5 mL試管中，加入無(wú)水乙醇1 mL，使其充分混合，519 nm處測(cè)定吸光值，此吸光值即為A0（A0多在0.7～0.9之間）。取DPPH溶液2 mL加入試管中，分別加入黃麻提取液20、30、40、50、60μL，加無(wú)水乙醇至3 mL，混合均勻，519 nm處測(cè)定2 min內(nèi)吸光值變化，起始吸光值記為Ai，終止吸光值記為Aj。以抗壞血酸（Vc）作為陽(yáng)性對(duì)照，濃度為1 mg/mL。清除率公式見(jiàn)式（2）：

式中：η—清除率，%；

Ai—黃麻提取液起始吸光值；

Aj—黃麻提取液終止吸光值；

A0—空白對(duì)照吸光值。

1.4.2 ABTS自由基清除試驗(yàn)

取10mmol/L水溶性維生素E（Trolox）溶液用超純水稀釋成0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mmol/L濃度梯度溶液。準(zhǔn)確移取10μL不同濃度標(biāo)準(zhǔn)Trolox溶液于96孔板中，超純水作空白對(duì)照，再向各孔中準(zhǔn)確移取10μL黃麻葉提取液，并加入20μL反應(yīng)液和170μL ABTS工作液，平行測(cè)定三次，室溫下反應(yīng)6 min，405 nm處，酶標(biāo)儀讀取各孔OD值。

1.4.3 FRAP鐵還原力試驗(yàn)

配制100 mmol/L硫酸亞鐵（FeSO4）溶液，取 FeSO4母液用超純水稀釋至 0.10、0.20、0.25、0.50、1.00、2.00 mmol/L待用。準(zhǔn)確移取5μL上述不同濃度FeSO4標(biāo)準(zhǔn)液、黃麻葉提取液于96孔板中，超純水做空白對(duì)照，并向各孔板中加入180μL FRAP工作液，平行測(cè)定三次，室溫下反應(yīng)3～5min。593 nm處，酶標(biāo)儀讀取各孔OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

圖1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Gallic acid standard curve

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如下：

式中：x—沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度，mg/mL；

y—沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品吸光值。

線性范圍為0.075～0.450 mg/mL。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總多酚提取量的影響

由圖2可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在50%時(shí)有最大提取量，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)50%時(shí)，提取量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而減少。這可能是因?yàn)槟承┒喾拥臉O性較大，當(dāng)增大乙醇體積分?jǐn)?shù)時(shí)，降低了多酚在細(xì)胞內(nèi)外的交換［12］。而且乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)大會(huì)浪費(fèi)原料，因此將乙醇體積分?jǐn)?shù)控制在50%為宜。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總多酚提取量影響Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on total polyphenol extraction

2.2.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)總多酚提取量的影響

由圖3可知，在反應(yīng)時(shí)間為1.0～2.5 h時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間增加，總多酚提取量增加，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為2.5 h時(shí)，總多酚提取量達(dá)到最大，之后隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，總多酚提取量降低，這可能是因?yàn)槎喾宇愇镔|(zhì)本身具有氧化性，長(zhǎng)時(shí)間暴露在提取液中導(dǎo)致部分多酚化合物發(fā)生氧化反應(yīng)，使得總多酚提取量降低［13］，因此將反應(yīng)時(shí)間控制在2.5 h。

圖3 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)總多酚提取量影響Fig.3 Effect of different extraction time on total polyphenol extraction

2.2.3 液料比對(duì)總多酚提取量的影響

由圖4可知，在測(cè)定范圍內(nèi)，總多酚的提取量隨液料比升高而升高。這可能是由于增加提取液體積可以增大溶劑與提取物的接觸面積，有利于總多酚提取。當(dāng)提取劑逐漸增多時(shí)，多余的提取劑將提取液稀釋，傳質(zhì)速率減小，單位體積的提取劑中多酚提取量變小，并逐漸達(dá)到飽和。計(jì)算可知，當(dāng)液料比為30∶1時(shí)黃麻總多酚提取量比50∶1處理僅減少了2.5%，從經(jīng)濟(jì)角度考慮，選擇液料比為 30∶1（mL/g）為宜。

圖4 不同液料比對(duì)總多酚提取量的影響Fig.4 Effect of different material ratios on total polyphenol extraction

2.2.4 反應(yīng)溫度對(duì)總多酚提取量的影響

由圖5可知，在50～90℃之間，隨著反應(yīng)溫度的增加，總多酚提取量隨之增加。這可能是因?yàn)榉磻?yīng)溫度越高，分子平均運(yùn)動(dòng)速度越快，擴(kuò)散速率也就越快，越有利于植物中物質(zhì)的提取。在90～100℃之間，總多酚提取量呈下降趨勢(shì)。這可能是由于有部分多酚類物質(zhì)在高溫下結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致多酚含量下降［14］，因此，選擇反應(yīng)溫度90℃為宜。

圖5 反應(yīng)溫度對(duì)總多酚提取量的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on total polyphenol extraction

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比為自變量，黃麻提取液中總多酚提取量為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)條件及總多酚提取量Table 2 Response surface test conditions and total polyphenol extraction

采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸擬合分析，得二次多項(xiàng)式回歸方程為：

式中A、B、C、D分別為反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比，Y為黃麻葉中總多酚提取量。相關(guān)系數(shù)為0.8201，說(shuō)明該模型擬合度良好，試驗(yàn)誤差小，可用此模型對(duì)黃麻提取液中總多酚提取量進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

由表3結(jié)果顯示，D、A2、C2、D2對(duì)總多酚提取量的影響極顯著，交互項(xiàng)影響均不顯著，失擬項(xiàng)影響不顯著，說(shuō)明回歸方程擬合度良好，未知因素對(duì)其干擾較小。Model中p=0.0038（p＜0.05），說(shuō)明選用的二次多項(xiàng)式模型有高度顯著性，得到的回歸線性方程能夠反應(yīng)吸光值與各因素之間的關(guān)系，各因素對(duì)吸光值影響大小順序?yàn)椋阂毫媳龋―）＞反應(yīng)溫度（A）＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）＞反應(yīng)時(shí)間（B）。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

利用Design-Expert 8.0.6軟件得到二次回歸方程的響應(yīng)面圖，以此評(píng)價(jià)試驗(yàn)因素之間的交互強(qiáng)度，以確定最優(yōu)工藝參數(shù)，響應(yīng)面圖見(jiàn)圖6。

圖6表示因素兩兩之間對(duì)響應(yīng)值影響大小，曲面越陡峭說(shuō)明影響越大，從圖中可知，液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用對(duì)總多酚提取量影響較大，這與方差分析結(jié)果一致。經(jīng)Design-Expert8.0.6軟件優(yōu)化得到黃麻葉總多酚最優(yōu)提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為49.80%，反應(yīng)時(shí)間為2.34 h，液料比為33.93∶1（mL/g），反應(yīng)溫度為87.85℃，這與單因素優(yōu)化結(jié)果基本一致。結(jié)合實(shí)際所需，最終確定提取工藝為：稱量1.50 g黃麻葉粉末，加入45 mL的50%乙醇，90℃下提取2.5 h。

圖6 各因素與總提取量之間的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface diagram between various factors and total extraction

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

稱取1.50 g黃麻樣品，按照響應(yīng)面最優(yōu)提取條件，平行實(shí)驗(yàn)三次，測(cè)定總多酚提取量。三次平行實(shí)驗(yàn)得到黃麻總多酚提取量分別為 13.710、13.698、13.712 mg/g，平均總多酚提取量為13.707 mg/g，這與響應(yīng)面預(yù)測(cè)值13.738 mg/g相對(duì)誤差為0.2%，說(shuō)明優(yōu)化得到的提取工藝穩(wěn)定、可靠。

2.6 黃麻葉片提取液抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

2.6.1 DPPH自由基清除試驗(yàn)

由式（2）計(jì)算得各濃度下清除率，以濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)，如圖7、8所示。

黃麻提取液DPPH抗氧化能力曲線方程為：

式中：x—黃麻提取液濃度，μg/mL；

y—黃麻提取液清除率，%。

相關(guān)系數(shù)為：0.984。

Vc標(biāo)準(zhǔn)樣品中，DPPH抗氧化能力曲線方程為：

式中：x—Vc標(biāo)準(zhǔn)品濃度，μg/mL；

y—Vc清除率，%。

線性范圍為0.36～1.80μg/mL，相關(guān)系數(shù)為0.946。根據(jù)式（5）得到黃麻提取液DPPH的IC50為2.017μg/mL，根據(jù)式（6）得到Vc標(biāo)準(zhǔn)品的IC50為0.773μg/mL，計(jì)算可知黃麻提取液DPPH自由基清除效率約為等濃度下Vc的38.32%。

圖7 黃麻提取液DPPH抗氧化能力曲線Fig.7 DPPH antioxidant capacity curve of jute extract

圖8 Vc陽(yáng)性對(duì)照DPPH抗氧化能力曲線Fig.8 Vc positive control DPPH antioxidant capacity curve

2.6.2 ABTS自由基陽(yáng)離子抑制抗氧化試驗(yàn)

在ABTS自由基清除試驗(yàn)中，以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定吸光值為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)，如圖9所示，得到線性方程為：

式中：x—Trolox標(biāo)準(zhǔn)品吸光值；

y—Trolox標(biāo)準(zhǔn)品濃度，mmol/L。

線性范圍為0.1～1.0 mmol/L，相關(guān)系數(shù)為0.9918。將黃麻提取液吸光值代入式（7）中得到y(tǒng)=0.6673 mmol/L，因此黃麻提取液總抗氧化能力與0.6673 mmol/L的Trolox溶液相當(dāng)。

圖9 Trolox標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.9 Trolox standard sample standard curve

2.6.3 FRAP總抗氧化能力試驗(yàn)

酶標(biāo)儀讀取各孔吸光值，以標(biāo)準(zhǔn)品吸光值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖10所示，得到線性方程為：

式中：x—FeSO4標(biāo)準(zhǔn)品吸光值；

y—FeSO4標(biāo)準(zhǔn)品濃度，mmol/L。

線性范圍為0.1～2.0 mmol/L，相關(guān)系數(shù)為0.9980。三次平行實(shí)驗(yàn)黃麻提取液吸光值代入方程計(jì)算得到y(tǒng)=1.956、1.938、1.968 mmol/L，取平均值為1.954 mmol/L，因此黃麻提取液的抗氧化能力與1.954 mmol/L FeSO4的抗氧化能力相當(dāng)。

圖10 FeSO4標(biāo)準(zhǔn)品曲線Fig.10 FeSO4 standard curve

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)采用冷凝回流法提取菜用黃麻葉中總多酚，響應(yīng)面法得到黃麻葉中總多酚最佳提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，液料比為30∶1（mL/g），反應(yīng)溫度90℃，反應(yīng)時(shí)間2.5 h。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，優(yōu)化的結(jié)果穩(wěn)定、可靠，為黃麻葉中總多酚的后續(xù)開(kāi)發(fā)和提取等研究提供了參考。在黃麻葉提取液抗氧化試驗(yàn)中，DPPH清除自由基能力約為陽(yáng)性對(duì)照Vc的38.32%，ABTS清除自由基能力相當(dāng)于0.6673 mmol/L的Trolox標(biāo)準(zhǔn)品，F(xiàn)RAP試驗(yàn)中抗氧化能力與1.954 mmol/L FeSO4的抗氧化能力相當(dāng)。

黃麻中含有多種有效成分，尤其是多酚類化合物，多個(gè)酚羥基的存在能夠結(jié)合大量有機(jī)體產(chǎn)生的自由基而生成羥基自由基，使機(jī)體免于自由基的傷害。雖然黃麻在中國(guó)古代就有食用的記載，但如今黃麻卻并不被人們所熟知。因此，探究黃麻中多酚最佳提取條件能為黃麻進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供一定技術(shù)支持。目前多利用超聲波法提取黃麻中總多酚，雖然該方法簡(jiǎn)單易操作，提取時(shí)間也較短，但是超聲提取重復(fù)性較低。羅玉芳等［6］利用超聲法提取菜用黃麻色素，所用液料比為80∶1（mL/g），相比于冷凝回流提取法，超聲提取所用溶劑量偏大，易造成浪費(fèi)。杜彬等［15］在優(yōu)化板栗花中多酚提取工藝時(shí)指出，液料比是影響多酚提取的關(guān)鍵因素，這與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)在提取菜用黃麻總多酚時(shí)，不同多酚之間的極性差異會(huì)導(dǎo)致總多酚提取量有所不同，這需要研究有機(jī)溶劑最佳體積分?jǐn)?shù)，來(lái)獲得最大總多酚提取量。黃麻中多酚種類較多，對(duì)于其中何種多酚具有抗氧化活性還有待進(jìn)一步研究。冷凝回流提取法也存在一些不足之處，如提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致能源浪費(fèi)，而且要達(dá)到較大提取量還需進(jìn)行多次提取，這給提取操作帶來(lái)了一定困難。