豐錦春，李宇翔，李丹，楊亮，朱麗萍，吳濤

新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，烏魯木齊830011

乳腺癌是當(dāng)今女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降及死亡的重要原因，目前臨床上仍然缺乏針對腫瘤轉(zhuǎn)移的有效對策[1]。利用分子標(biāo)志物預(yù)測腫瘤患者轉(zhuǎn)移的潛能，對制定有效的個體化治療方案具有重要作用，同時對提高患者的生存率和生活質(zhì)量也有重要意義。研究顯示，膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營養(yǎng)因子受體α1(GFRα1)與乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、胰腺癌等多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)[2～4]，其表達(dá)與乳腺癌臨床分期及Her-2陽性率呈正相關(guān)關(guān)系[5]。一項(xiàng)多中心隊(duì)列研究結(jié)果顯示，GFRα1甲基化改變與胃癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6]。但是目前關(guān)于乳腺癌組織GFRα1基因甲基化狀態(tài)與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系鮮見報(bào)道，為此我們進(jìn)行了如下研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入標(biāo)準(zhǔn)：①行乳腺癌改良根治術(shù)，術(shù)中行腋窩Ⅰ、Ⅱ組淋巴結(jié)清掃；②經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)為浸潤性乳腺癌；③臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡<18歲；②合并其他惡性腫瘤；③乙肝表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎抗體(HCV-Ab)或人免疫缺陷病毒抗體(HIV-Ab)陽性；④妊娠期婦女；⑤術(shù)前接受過化療、放療、內(nèi)分泌治療或免疫治療；⑥男性乳腺癌患者；⑦特殊類型乳腺癌，如炎性乳癌、派杰病、黏液癌、髓樣癌、小管癌等。選擇2016～2019年于我院行手術(shù)治療、符合上述標(biāo)準(zhǔn)的女性乳腺癌患者100例，根據(jù)術(shù)后淋巴結(jié)病理結(jié)果分為轉(zhuǎn)移組及未轉(zhuǎn)移組，每組各50例。轉(zhuǎn)移組年齡(51.72±12.99)歲，絕經(jīng)19例，BMI(23.08±2.28)kg/m2；病理類型：浸潤性導(dǎo)管癌46例、浸潤性小葉癌4例；激素受體(ER)陽性29例，孕激素受體(PR)陽性26例，原癌基因HER-2陽性12例。未轉(zhuǎn)移組年齡(49.30±11.39)歲，絕經(jīng)16例，BMI(23.17±2.03)kg/m2；病理類型：浸潤性導(dǎo)管癌43例、浸潤性小葉癌7例；ER陽性35例，PR陽性31例，HER-2陽性7例。兩組上述資料均具有可比性(P均>0.05)。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審核，患者均簽署知情同意書。

1.2 癌組織GFRα1基因甲基化狀態(tài)檢測 采用BSP法。收集兩組術(shù)中留取的原發(fā)腫瘤組織標(biāo)本，置于液氮中速凍，-80 ℃冰箱保存。將凍存組織剪碎，使用EasyPure Genomic DNA Kit試劑盒提取DNA，EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit(QIAGEN)試劑盒對DNA進(jìn)行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化。根據(jù)GenBank中人GFRα1基因序列獲得啟動子區(qū)序列，使用Methyl Primer Express v1.0軟件設(shè)計(jì)甲基化引物，進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒進(jìn)行回收，pEASY-T1 Cloning Kit試劑盒進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化。利用BIQ-Analyzer軟件對測序成功的數(shù)據(jù)進(jìn)行甲基化位點(diǎn)及數(shù)量統(tǒng)計(jì)，通過序列比對確定20個CpG位點(diǎn)的C是否發(fā)生甲基化變?yōu)門，計(jì)算兩組甲基化率。

1.3 癌組織GFRα1蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。取兩組凍存組織，研磨后加入RIPA裂解液，充分混勻。4 ℃條件下放置60 min，12 000 r/min離心15 min，收集上清。BCA法測定蛋白濃度，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳；考馬斯亮藍(lán)染色，漂洗后加入適量5×SDS-PAGE loading buffer(含β-巰基乙醇)，100 ℃沸水加熱處理5 min，使蛋白充分變性。12 000 r/min離心5 min，取上清備用；PVDF轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST沖洗3次×5 min。加入GFRα1及內(nèi)參β-actin一抗(稀釋比例分別為1∶200、1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，加入山羊抗兔IgG二抗(稀釋比例分別為1∶5 000、1∶15 000)，室溫孵育1 h。顯色后采用ChemiScope mini化學(xué)發(fā)光儀檢測、拍照并分析條帶灰度值,計(jì)算GFRα1蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組癌組織GFRα1甲基化率比較 轉(zhuǎn)移組、未轉(zhuǎn)移組癌組織GFRα1基因甲基化率分別為76.333%±19.036%、52.000%±14.842%，兩組比較P<0.05。轉(zhuǎn)移組GFRα1基因CpG6、CpG13、CpG14、CpG16甲基化率均高于未轉(zhuǎn)移組(P均<0.05)，兩組其他CpG位點(diǎn)甲基化率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1、表2。

表1 兩組癌組織GFRα1基因第1～10個CpG位點(diǎn)的甲基化率比較

表2 兩組癌組織GFRα1基因第11～20個CpG位點(diǎn)的甲基化率比較

2.2 兩組癌組織GFRα1蛋白表達(dá)比較 轉(zhuǎn)移組、未轉(zhuǎn)移組癌組織GFRα1蛋白相對表達(dá)量分別為0.679±0.044、0.495±0.064，兩組比較P<0.05。

2.3 GFRα1基因甲基化率與蛋白表達(dá)的關(guān)系 GFRα1基因甲基化率與蛋白相對表達(dá)量呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.703，P=0.023)。

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)是神經(jīng)營養(yǎng)因子超家族的一員，GDNF家族受體有4個，分別為GFRα1、GFRα2、GFRα3、GFRα4，其對應(yīng)的配體分別為GDNF、NRTN、ARTN、PSPN[7]。受體GFRα1屬于膜受體，與配體GDNF結(jié)合后，在生理?xiàng)l件下的主要功能是促進(jìn)神經(jīng)元的生長發(fā)育和遷移[8]。近年來隨著神經(jīng)-內(nèi)分泌-腫瘤研究的不斷深入，越來越多的研究表明GDNF及其受體GFRα1在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。已有研究證實(shí)，GFRα1異常表達(dá)可影響腫瘤的生物學(xué)行為，其在乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌及神經(jīng)膠質(zhì)瘤中發(fā)揮促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的作用[9]。GFRα1在腫瘤治療過程中也有一定作用，異常表達(dá)的GFRα1可導(dǎo)致骨肉瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性[10]。在乳腺癌方面，GFRα1高表達(dá)可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲及遷移[4]。研究表明，GFRα1在Luminal型乳腺癌組織中大量表達(dá)，在正常乳腺組織中表達(dá)很少，阻斷腫瘤細(xì)胞GFRα1表達(dá)可發(fā)揮抗腫瘤作用，說明GFRα1可能成為治療Lumial型乳腺癌的靶點(diǎn)之一[11]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在三陰性乳腺癌組織中GFRα1的環(huán)狀RNA表達(dá)增加，并與患者的生存率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示GFRα1有可能作為三陰性乳腺癌的潛在診斷及治療靶點(diǎn)[12]。

DNA甲基化是哺乳動物細(xì)胞中最穩(wěn)定的表觀遺傳修飾之一，不僅能夠在組織中穩(wěn)定存在，而且即使DNA甲基化改變只發(fā)生在少數(shù)細(xì)胞中也可以被靈敏地檢出。在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中，除了相關(guān)基因發(fā)生結(jié)構(gòu)變異失活外，轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)附近CpG島的異常甲基化是其失活的主要途徑。目前，DNA甲基化檢測已經(jīng)逐步應(yīng)用于癌前病變診斷[13～15]、化療敏感性[16～19]及腫瘤患者預(yù)后預(yù)測[20,21]等方面，并且在預(yù)測腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)方面也具有良好的應(yīng)用前景。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)移組GFRα1甲基化率顯著高于未轉(zhuǎn)移組，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)在CpG6、CpG13、CpG14、CpG16四個位點(diǎn)的甲基化率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在胃癌的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，GFRα1基因去甲基化后可重新激活該基因表達(dá)，導(dǎo)致胃癌轉(zhuǎn)移的發(fā)生[6]。這與本研究結(jié)果并不符，可能與不同腫瘤之間GFRα1的表達(dá)機(jī)制不同有關(guān)。GFRα1的調(diào)控是一個復(fù)雜的、多因素參與的過程，未來需進(jìn)行更大規(guī)模的多中心隊(duì)列研究來進(jìn)一步證實(shí)這一問題。

基因啟動子區(qū)甲基化異常升高可以導(dǎo)致諸如細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因、抑癌基因、凋亡基因等重要調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄沉默，使得相關(guān)基因表達(dá)降低或缺失，從而促進(jìn)腫瘤形成和轉(zhuǎn)移[22]。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)移組GFRα1蛋白表達(dá)高于未轉(zhuǎn)移組，且GFRα1基因甲基化率與蛋白相對表達(dá)量呈正相關(guān)關(guān)系；提示GFRα1蛋白高表達(dá)可能促進(jìn)了乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而GFRα1基因甲基化率增高可能是其蛋白水平異常表達(dá)的原因之一，這一推測及其具體機(jī)制仍待進(jìn)一步研究證實(shí)。