歐維正，劉海蘭，雷毅娜，王瓊，秦萬，游俊飛

1貴陽市公共衛(wèi)生救治中心，貴陽550003；2貴州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院

結(jié)核病(TB)是由結(jié)核分枝桿菌(MTB)感染引起的慢性傳染病，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報道，2017年全球約有1 000萬例新發(fā)患者，其中有640萬例新發(fā)患者被正式通報給國家有關(guān)部門，預(yù)估數(shù)與報告數(shù)之間的差距主要是由于病例漏報以及漏診造成的[1]。目前，肺結(jié)核的診斷主要依靠患者癥狀、胸部影像學(xué)檢查及傳統(tǒng)的痰涂片抗酸染色、羅氏固體培養(yǎng)(簡稱“L-J培養(yǎng)”)。但是，肺結(jié)核患者的癥狀及影像學(xué)檢查往往缺乏特異性，痰涂片抗酸染色的靈敏度及特異度均較低，L-J培養(yǎng)耗時長，以上檢測手段均難以滿足肺結(jié)核早期快速診斷及高病原學(xué)陽性率的要求。近年來，WHO先后推薦MTB多色巢式熒光定量PCR(Xpert MTB/RIF)、環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)(TB-LAMP)[2]作為快速分子診斷技術(shù)應(yīng)用于臨床。在既往報道中，Xpert MTB/RIF、TB-LAMP兩種新技術(shù)多采用痰液作為檢測樣本，而以BALF作為檢測樣本并與傳統(tǒng)檢測方法進行比較的報道不多。為此，我們進行了如下研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2019年9月貴陽市公共衛(wèi)生救治中心住院及門診送檢的BALF樣本165例份。參照肺結(jié)核診斷標準[3]，165例患者中臨床診斷為肺結(jié)核131例，其中男70例、女61例，年齡(46.8±19.9)歲，既往感染9例；其他呼吸道疾病34例，其中男20例、女14例，年齡(48.6±20.9)歲，肺癌11例、慢性阻塞性肺疾病5例、肺部感染18例。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審核，患者均簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

1.2.1 涂片抗酸染色 將送檢的BALF按檢驗規(guī)程[4]進行抗酸染色檢測，抗酸染色試劑購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司[注冊號為粵珠食藥監(jiān)械(準)字2013第1400066號]，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。結(jié)果判定標準：連續(xù)觀察300個不同視野均未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌(AFB)定義為AFB陰性(簡稱涂陰)，連續(xù)觀察300個不同視野至少發(fā)現(xiàn)1條AFB定義為AFB陽性(簡稱涂陽)。

1.2.2 L-J培養(yǎng) 將送檢的BALF用相當(dāng)于1～2倍樣本體積的4% NaOH處理，參照檢驗規(guī)程[4]進行L-J培養(yǎng)，L-J培養(yǎng)基和對硝基苯甲酸(PNB)培養(yǎng)基均購自珠海市銀科醫(yī)學(xué)工程有限公司[注冊號為粵食藥監(jiān)械(準)字2012第2400717號]，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。結(jié)果判定標準：若培養(yǎng)滿8周仍無菌生長即報告培養(yǎng)陰性，若培養(yǎng)滿8周分離到菌株，則將其參照檢驗規(guī)程[4]進行PNB試驗；如菌株在PNB培養(yǎng)基上生長，則鑒定為非結(jié)核分枝桿菌(NTM)，反之則為MTB。

1.2.3 TB-LAMP檢測 取60 μL BALF放入吸附劑試管中，充分混勻后90 ℃加熱裂解5 min。將吸附試管裝到樣本處理管上，搖晃8～10次后得到初步提取的核酸，在樣本處理管上加上滴注蓋，輕壓樣本處理管，將樣本滴入到反應(yīng)管中。試劑干燥于管蓋上，蓋上管蓋，充分混合；67 ℃條件下進行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)40 min，通過儀器配套的紫外線激發(fā)熒光觀察反應(yīng)結(jié)果。TB-LAMP試劑購自日本榮研化學(xué)株式會社(注冊號為國械注進20143405184號)，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。結(jié)果判定標準：發(fā)出綠色熒光判定為陽性，未發(fā)出熒光判定為陰性。

1.2.4 Xpert MTB/RIF檢測 取1 mL BALF置于有螺旋蓋的前處理管中，加入相當(dāng)于2倍樣本體積的處理液，旋緊前處理管；在渦旋振蕩器上渦旋振蕩15～30 s，室溫靜置15 min，使樣本充分液化。打開反應(yīng)盒，取2 mL處理后樣品，從加樣孔緩慢加入反應(yīng)盒，將反應(yīng)盒置于檢測模塊，使用GeneXpert 檢測系統(tǒng)(美國Cepheid公司)進行自動化檢測。Gene Xpert MTB/RIF試劑盒購自美國Cepheid公司[注冊號為國食藥監(jiān)械(進)字2014第3401153號]，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。反應(yīng)結(jié)束后，直接在檢測系統(tǒng)窗口下觀察檢測結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以率表示，涂陽與涂陰樣本中L-J培養(yǎng)、TB-LAMP、Xpert MTB/RIF檢測MTB陽性率的比較采用χ2檢驗。以臨床診斷為金標準，計算L-J培養(yǎng)、TB-LAMP、Xpert MTB/RIF檢測MTB的靈敏度、特異度和準確性，靈敏度的比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4種方法的檢測結(jié)果 165例份BALF樣本中，涂陽25例份、涂陰140例份，陽性率15.15%(25/165)；L-J培養(yǎng)陽性40例份、陰性125例份，陽性率24.24%(40/165)，陽性菌株經(jīng)PNB試驗鑒定均為MTB；TB-LAMP檢測陽性66例份、陰性99例份，陽性率40.00%(66/165)；Xpert MTB/RIF檢測陽性48例份、陰性117例份，陽性率29.09%(48/165)，陽性樣本中利福平(RIF)敏感38例份、耐藥9例份、不確定1例份。

19例份TB-LAMP檢測陽性，Xpert MTB/RIF檢測陰性；28例份TB-LAMP檢測陽性，L-J培養(yǎng)陰性；1例份Xpert MTB/RIF檢測陽性，TB-LAMP檢測陰性；11例份Xpert MTB/RIF檢測陽性，L-J培養(yǎng)陰性；2例份L-J培養(yǎng)陽性，TB-LAMP檢測陰性；3例份L-J培養(yǎng)陽性，Xpert MTB/RIF檢測陰性；1例份抗酸染色AFB、TB-LAMP檢測陽性，而Xpert MTB/RIF檢測、L-J培養(yǎng)陰性。

2.2 涂陽與涂陰樣本中L-J培養(yǎng)、TB-LAMP及Xpert MTB/RIF檢測MTB陽性率比較 在涂陽樣本中，L-J培養(yǎng)、TB-LAMP及Xpert MTB/RIF檢測MTB陽性率分別為84.00%(21/25)、100%(25/25)、96.00%(24/25)，3種方法檢測MTB陽性率比較P>0.05；在涂陰樣本中，L-J培養(yǎng)、TB-LAMP及Xpert MTB/RIF檢測MTB陽性率分別為13.57%(19/140)、29.29%(41/140)、17.14 %(24/140)，兩兩比較P均<0.05。

2.3 L-J培養(yǎng)、TB-LAMP及Xpert MTB/RIF檢測對肺結(jié)核的診斷效能比較 見表1。

表1 L-J培養(yǎng)、TB-LAMP及Xpert MTB/RIF檢測對肺結(jié)核的診斷效能

3 討論

早期準確診斷是TB患者得以及時治療的關(guān)鍵，提高診斷技術(shù)則是發(fā)現(xiàn)患者的核心[5,6]。涂片抗酸染色是MTB最傳統(tǒng)的檢測方法之一，由于操作簡單，在實驗室中廣泛開展，但其靈敏度和特異度不足，易造成誤診和漏診。L-J培養(yǎng)亦是MTB傳統(tǒng)的檢測方法，較涂片抗酸染色的靈敏度和特異度有所提高，但檢測周期長(4～8周)是其應(yīng)用受限的主要原因。目前，新型分子診斷技術(shù)在全球廣泛開展，TB-LAMP和Xpert MTB/RIF檢測以其簡便、快捷、靈敏度高的特點受到高度關(guān)注。TB-LAMP檢測是一種新型的核酸恒溫擴增技術(shù)，不依賴溫度循環(huán)變化，只需恒定溫度就能擴增反應(yīng)。其原理主要是對MTB DNA上gyrB基因和IS6110基因的6個區(qū)域設(shè)計4條特異性引物，利用鏈置換反應(yīng)，對目標DNA進行大量擴增，檢測結(jié)果可在1 h內(nèi)完成[7]。Xpert MTB/RIF采用半巢式全自動實時熒光定量PCR原理，將樣品處理、核酸擴增、目標序列的實時檢測整合于一體，通過對MTB DNA特有的序列rpoB基因上RIF耐藥相關(guān)81 bp的核心區(qū)域(RRDR)進行檢測，可同時檢測MTB和RIF耐藥性[8]，標本處理完上機2 h內(nèi)可獲得檢測結(jié)果。

現(xiàn)階段我國約有70%涂陰肺結(jié)核患者[9]，其臨床癥狀不明顯，咳痰少甚至沒有，故很難留取合格的痰液樣本。支氣管鏡檢查可采集得到BALF，其具有污染率低(采集不經(jīng)過口腔和咽喉)、菌含量高(灌洗部位為病灶所在的肺葉、肺段)的優(yōu)點，是理想的病原學(xué)檢測樣本，對其進行檢測可增加MTB陽性檢出率，進而提高對肺結(jié)核的診斷效能。但單純地依靠傳統(tǒng)方法檢測，仍然難以滿足肺結(jié)核病原學(xué)診斷的需求。本研究對165例BALF樣本同時采用4種方法檢測，涂片抗酸染色陽性率最低，顯示該方法檢測的靈敏度較差；對于涂陰樣本，TB-LAMP檢測陽性率高于L-J培養(yǎng)和Xpert MTB/RIF檢測。該結(jié)果與張偉陽等[10]、劉權(quán)賢等[11]應(yīng)用上述方法檢測痰液樣本的結(jié)果一致。雖然L-J培養(yǎng)對涂陰樣本的檢測陽性率也有較大提高，但是該方法耗時長，遠不及TB-LAMP和Xpert MTB/RIF的快速檢測具有優(yōu)勢。

MTB傳統(tǒng)檢測方法不僅靈敏度低，還不能區(qū)分MTB和NTM，抗酸染色和L-J培養(yǎng)陽性也需要進一步進行菌種鑒定。本研究L-J培養(yǎng)的40例份陽性菌株雖然經(jīng)PNB鑒定全為MTB，但也有鑒定為NTM的報道[12]。TB-LAMP和Xpert MTB/RIF檢測均是以MTB基因組中保守的管家基因作為檢測靶標，保證了檢測結(jié)果的特異性。本研究以臨床診斷為金標準，TB-LAMP、Xpert MTB/RIF檢測及L-J培養(yǎng)診斷肺結(jié)核的特異度均為100%，但TB-LAMP檢測診斷肺結(jié)核的靈敏度明顯高于Xpert MTB/RIF檢測和L-J培養(yǎng)。孫嬌[13]等研究顯示，TB-LAMP和L-J培養(yǎng)的靈敏度差異有統(tǒng)計學(xué)意義。虞忻等[14]研究顯示，Xpert MTB/RIF和L-J培養(yǎng)的靈敏度差異無統(tǒng)計學(xué)意義。以上均與本研究結(jié)果相符。有文獻報道，以單拷貝基因為檢測靶標的方法比以多拷貝基因為檢測靶標的方法靈敏度低[15]。TB-LAMP的檢測靶標為多拷貝基因IS6110和單拷貝基因gyrB，因此比只有1個單拷貝基因rpoB作為檢測靶標的Xpert MTB/RIF靈敏度高。另外，TB-LAMP沒有如PCR變性、退火和延伸等溫度循環(huán)步驟，擴增效率明顯提高[16]。以上可能是TB-LAMP診斷肺結(jié)核的靈敏度高于Xpert MTB/RIF的原因。不同于TB-LAMP和Xpert MTB/RIF死菌活菌都能檢測，L-J培養(yǎng)只能檢測活菌。如果存在樣本堿處理不當(dāng)或者培養(yǎng)基營養(yǎng)不良等外在因素，均有可能導(dǎo)致L-J培養(yǎng)的檢測靈敏度降低。

本研究結(jié)果顯示，部分樣本采用不同的檢測方法得到的結(jié)果也不同，除上述原因外，L-J培養(yǎng)陽性而TB-LAMP和(或)Xpert MTB/RIF檢測陰性的情況，或許是因為樣本載菌量少且受本身方法取樣量限制而導(dǎo)致的[13]。說明任何一種方法都有其局限性，多種方法聯(lián)合檢測可提高肺結(jié)核的病原學(xué)診斷率。本研究樣本數(shù)量有限，沒有分子生物學(xué)假陽性的結(jié)果，但不排除分子生物學(xué)檢測技術(shù)因方法學(xué)本身的局限性而導(dǎo)致的假陽性，嚴格控制實驗室污染是分子生物學(xué)檢測技術(shù)取得可靠結(jié)果的關(guān)鍵。

綜上所述，BALF中涂片抗酸染色陽性率最低，只適合肺結(jié)核的初篩；L-J培養(yǎng)和TB-LAMP、Xpert MTB/RIF檢測均能大幅提高涂陰肺結(jié)核的病原學(xué)診斷率，其中TB-LAMP檢測的陽性率及其診斷肺結(jié)核的靈敏度最高。