趙進(jìn)，王昌敏

新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院，烏魯木齊830001

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種由于漿細(xì)胞惡性增殖導(dǎo)致的血液惡性腫瘤，多發(fā)于老年人[1]。MM發(fā)病率占所有血液性惡性腫瘤的13%，是臨床常見的惡性腫瘤之一[2]。MM的主要臨床特征為溶骨性骨病變、高鈣血癥、腎功能不全、免疫球蛋白水平下降和骨髓血管生成增加等[3]。維生素D是骨骼代謝的基本介質(zhì)，具有調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)的作用，維生素D缺乏可影響骨礦化和骨吸收過程。維生素D受體(VDR)屬于二類核受體家族，維生素D主要通過作用于VDR而發(fā)揮生物學(xué)作用。盡管包括蛋白酶體抑制劑和免疫調(diào)節(jié)劑在內(nèi)的新型藥物可有效改善MM患者的臨床癥狀，但其整體治療效果仍不理想，患者中位生存期僅為7年[4,5]。微小RNA(miRNA)是內(nèi)源性的非編碼RNA，主要通過與靶基因mRNA結(jié)合而調(diào)控基因表達(dá)。研究表明，miRNA在包括MM在內(nèi)的多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[6,7]。2018年1月～2019年12月，本研究觀察了miR-125a-5p在MM細(xì)胞中的表達(dá)變化及其對(duì)細(xì)胞增殖的影響，并探討其與VDR的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系U266、人正常骨髓原代細(xì)胞均購自美國ATCC細(xì)胞庫。主要試劑：10%胎牛血清購自美國Gibco公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購自武漢普諾賽生命科技有限公司，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、oligo dT、SYBR MasterMix均購自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；qPCR試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，TRIzol試劑盒購自日本TaKaRa公司，抗VDR抗體購自美國Abcam公司。miR-125a-5p引物序列由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.2 U266細(xì)胞、人正常骨髓原代細(xì)胞 miR-125a-5p表達(dá)檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。將U266細(xì)胞、人正常骨髓原代細(xì)胞置于含10%胎牛血清和適量青-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的兩種細(xì)胞，采用TRIzol法提取總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄酶在20 μL體系中合成cDNA。miR-125a-5p上游引物5′-AGCGCGTCCCTGAGACCCTTTAAC-3′，長度83 bp；下游引物5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′，長度164 bp。內(nèi)參GAPDH上游引物5′-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3′，長度18 bp；下游引物5′-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3′，長度23 bp。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-125a-5p相對(duì)表達(dá)量。

1.3 U266細(xì)胞、人正常骨髓原代細(xì)胞VDR蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。取生長狀態(tài)良好的 U266細(xì)胞、人正常骨髓原代細(xì)胞，在含有磷酸酶和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液中裂解細(xì)胞，提取總蛋白。BCA法統(tǒng)一定量蛋白樣品，隨后取相同量蛋白樣品通過SDS-PAGE電泳分離。電泳結(jié)束后將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至甲醇浸泡的PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。封閉結(jié)束后加入VDR及內(nèi)參GAPDH一抗(稀釋比例分別為1∶1 000、1∶500)，4 ℃孵育過夜；第二天加入HRP標(biāo)記的二抗(稀釋比例為1∶1 000)，室溫孵育1 h。TBST洗滌，ECL法顯影，條帶曝光后采用Image J 軟件分析條帶灰度值，計(jì)算VDR蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 miR-125a-5p與VDR的相互作用觀察 TargetScan軟件分析結(jié)果顯示miR-125a-5p可與VDR序列配對(duì)，見圖1。采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測miR-125a-5p與VDR的相互作用。方法如下：取對(duì)數(shù)生長期 U266細(xì)胞，以1×104/L接種于6孔板，作用24 h。將 U266細(xì)胞隨機(jī)分為四部分，分別采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染VDR-wt+NC質(zhì)粒、VDR-wt+miR-125a-5p mimic質(zhì)粒、VDR-mut+NC質(zhì)粒、VDR-mut+miR-125a-5p mimic質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48 h，加入PLB裂解細(xì)胞。將上清液轉(zhuǎn)移至不透光96孔酶標(biāo)板，加入Luciferase Assay Reagent Ⅱ(100 μL)反應(yīng)20 min，采用酶標(biāo)儀檢測熒光素酶相對(duì)活性。

圖1 TargetScan軟件分析miR-125a-5p與VDR序列配對(duì)結(jié)果

1.5 miR-125a-5p靶向VDR對(duì)U266細(xì)胞增殖能力影響的觀察

1.5.1 細(xì)胞分組處理 取生長狀態(tài)良好的U266細(xì)胞，以5×103/孔接種于96孔板。將細(xì)胞隨機(jī)分為inhibitor組、inhibitor+si-VDR組和空白對(duì)照組，inhibitor組采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染miR-125a-5p inhibitor及si-Con質(zhì)粒，inhibitor+si-VDR組轉(zhuǎn)染miR-125a-5p inhibitor及si-VDR質(zhì)粒，空白對(duì)照組轉(zhuǎn)染miR-NC及si-Con質(zhì)粒。

1.5.2 細(xì)胞增殖能力觀察 ①CCK-8法：三組轉(zhuǎn)染后0、24、48、72 h，每孔加入CCK-8溶液10 μL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，使用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的光密度(OD)值。②集落形成實(shí)驗(yàn)：將細(xì)胞培養(yǎng)液鋪于 6 孔板，三組按照1.5.1處理并轉(zhuǎn)染 24 h 后，加入瓊脂培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度為 1×104/L，混合均勻后接種于鋪有下層軟瓊脂的 6 孔板中。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，每孔加入 200 μL噻唑藍(lán)溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)過夜，顯微鏡下觀察集落形成情況，并對(duì)集落形成個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 U266細(xì)胞、人正常骨髓原代細(xì)胞miR-125a-5p表達(dá)比較 U266細(xì)胞、人正常骨髓原代細(xì)胞miR-125a-5p相對(duì)表達(dá)量分別為 2.79±0.65、1，二者比較P<0.01。

2.2 U266細(xì)胞、人正常骨髓原代細(xì)胞VDR蛋白表達(dá)比較 U266細(xì)胞、人正常骨髓原代細(xì)胞VDR蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.27±0.06、1，二者比較P<0.01。

2.3 miR-125a-5p與VDR的雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果 轉(zhuǎn)染VDR-wt+NC質(zhì)粒、VDR-wt+miR-125a-5p mimic質(zhì)粒的U266細(xì)胞細(xì)胞熒光素酶相對(duì)活性分別為1.00±0.38、0.23±0.05，二者比較P<0.01；轉(zhuǎn)染VDR-mut+NC質(zhì)粒、VDR-mut+miR-125a-5p mimic質(zhì)粒的U266細(xì)胞熒光素酶相對(duì)活性分別為1.02±0.03、1.05±0.04，二者比較P>0.05。

2.4 inhibitor組、inhibitor+si-VDR組和空白對(duì)照組細(xì)胞增殖能力比較 培養(yǎng)48、72 h， inhibitor組、inhibitor+si-VDR組和空白對(duì)照組培養(yǎng)相同時(shí)間下的OD值均依次升高，組間兩兩比較P均<0.05。見表1。inhibitor組、inhibitor+si-VDR組、空白對(duì)照組集落形成個(gè)數(shù)分別為 (143±25)、(359±38)、(421±11)個(gè)，組間兩兩比較P均<0.05。

表1 兩組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖能力比較

3 討論

研究顯示，80%～90%的MM患者可出現(xiàn)溶解性骨損傷、高鈣血癥、病理性骨折和脊髓壓迫綜合征等臨床癥狀，而骨骼系統(tǒng)相關(guān)并發(fā)癥是導(dǎo)致MM患者死亡的主要原因[8,9]。MM的發(fā)病原因至今仍不清楚，現(xiàn)有的研究表明miRNA可能在MM的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。miRNA是由19～25個(gè)堿基組成的短鏈非編碼RNA，其通過誘導(dǎo)靶基因mRNA的降解或抑制翻譯來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。miRNA的異常表達(dá)與人類癌癥發(fā)生密切相關(guān)，包括MM[10]。王金行等[11]研究顯示，miR-21可通過下調(diào)SPRY2表達(dá)而影響MM細(xì)胞的增殖和侵襲能力。郁佳佳等[12]研究報(bào)道，miR-202可增強(qiáng)MM細(xì)胞中B細(xì)胞活化因子表達(dá)。miR-125a屬于microRNA家族，定位于人類19號(hào)染色體上。最近的研究表明，miR-125a-5p在多種癌細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。張思毅等[13]報(bào)道，miR-125a-5p可抑制喉癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲[14]。但是miR-125a-5p在MM中的作用并不清楚。本研究結(jié)果顯示，U266細(xì)胞miR-125a-5p表達(dá)明顯高于人正常骨髓原代細(xì)胞，且inhibitor組細(xì)胞增殖能力明顯低于空白對(duì)照組；說明U266細(xì)胞miR-125a-5p表達(dá)升高可促進(jìn)其細(xì)胞增殖能力，證明miR-125a-5p在MM的發(fā)生過程中發(fā)揮腫瘤促進(jìn)因子作用。

研究報(bào)道，血清維生素D水平降低是導(dǎo)致MM骨骼并發(fā)癥發(fā)生的重要原因[17]。維生素D除了在維持骨骼動(dòng)態(tài)平衡方面的作用外，還具有腫瘤抑制因子作用， 可抑制腫瘤細(xì)胞增殖和血管生成，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[18,19]。趙偉強(qiáng)等[20]報(bào)道，MM患者血清維生素D3水平顯著降低[19]。研究發(fā)現(xiàn)，VDR在乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌等多種腫瘤中表達(dá)異常[21,22]，然而VDR在MM 中的報(bào)道并不多見。劉英等[23]曾報(bào)道VDR在MM患者中發(fā)生點(diǎn)突變，提示VDR在MM發(fā)生過程中可能具有重要作用。

本研究TargetScan分析結(jié)果顯示miR-125a-5p可與VDR序列配對(duì)，提示兩者之間可能存在靶向關(guān)系。進(jìn)一步采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示miR-125a-5p可與VDR結(jié)合而抑制熒光素酶活性，證實(shí)VDR是miR-125a-5p的作用靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，U266細(xì)胞miR-125a-5p表達(dá)明顯高于人正常骨髓原代細(xì)胞、VDR蛋白表達(dá)明顯低于人正常骨髓原代細(xì)胞，證實(shí)miR-125a-5p對(duì)VDR具有負(fù)性調(diào)控作用。一項(xiàng)對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠模型的研究顯示，miR-125a-5p可調(diào)節(jié)VDR的表達(dá)，從而影響多發(fā)性硬化的發(fā)生和發(fā)展[15]；另一項(xiàng)關(guān)于肝細(xì)胞肝癌的研究結(jié)果顯示，miR-125a-5p mimic可抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞VDR升高及維生素D的抗腫瘤作用[16]。以上結(jié)果均表明，miR-125a-5p與VDR之間存在有靶向關(guān)系，且二者之間呈負(fù)調(diào)控關(guān)系，與本研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，inhibitor組、inhibitor+si-VDR組和空白對(duì)照組培養(yǎng)48、72 h的OD值以及集落形成個(gè)數(shù)均依次升高；說明抑制VDR表達(dá)可促進(jìn)U266細(xì)胞增殖。因此，U266細(xì)胞中miR-125a-5p表達(dá)升高，miR-125a-5p可通過負(fù)性調(diào)控VDR表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞增殖。