費(fèi)喬曼，邱曼曼，賈子恒，王雯雯，楊冰，張玲

天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，天津300070

缺血性心臟病已成為全球第一大死亡原因，可引起心肌細(xì)胞大量缺失，其他類型的心血管疾病發(fā)展到最后也會伴隨心肌細(xì)胞缺失；心肌細(xì)胞嚴(yán)重缺失可導(dǎo)致剩余心肌收縮力不足，從而引起心衰。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是指長度大于200個(gè)核苷酸、通常不編碼蛋白質(zhì)的RNA分子，以序列特異性方式與DNA或RNA的堿基配對，從而參與調(diào)控基因表達(dá)[1,2]。LncRNA對心臟的發(fā)育至關(guān)重要，并參與了心衰、心肌梗死和心肌肥厚等常見心血管疾病的發(fā)生發(fā)展，具有調(diào)節(jié)心肌重塑、心肌再生和改善心臟功能的特性[3,4]。Hotair被認(rèn)為是一種心臟保護(hù)性LncRNA，其在心臟組織中過表達(dá)，可顯著抑制缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[5]。也有研究表明，在心肌梗死[6]、糖尿病性心肌病[7]等多種心臟疾病的動物模型中，Hotair表達(dá)明顯上調(diào)，但具體作用機(jī)制尚未闡明。2018年12月～2019年8月，本研究利用慢病毒載體原位感染的方法建立了心肌組織穩(wěn)定過表達(dá)Hotair的新生小鼠模型，為進(jìn)一步研究Hotair參與心臟疾病的相關(guān)機(jī)制提供可靠的動物模型。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動物：6周齡清潔級ICR雌鼠4只、雄鼠2只，體質(zhì)量約30 g，購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后按雌雄比2∶1進(jìn)行交配。細(xì)胞：293T細(xì)胞由天津醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)系實(shí)驗(yàn)室保存，DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。質(zhì)粒：慢病毒表達(dá)載體pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro購自北京安諾倫生物科技有限公司，慢病毒包裝質(zhì)粒包括pRSV-Rev(Addgene#12253)、pMDLg/pRRE(Addgene#12251)和pMD2.G(Addgene#12259)。主要試劑及儀器：DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Corning公司，轉(zhuǎn)染試劑DNAfectinTMplus購自鎮(zhèn)江愛必夢生物科技有限公司，PEG8000購自美國索萊寶公司，質(zhì)粒小提試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，兔多克隆抗組蛋白H3二甲基化的賴氨酸4(H3K4me2)抗體購自英國Abcam公司，兔多克隆抗組蛋白H3抗體購自美國Proteintech公司；實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀購自美國ABI公司，電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀均購自美國Bio-Rad公司。

1.2 過表達(dá)Hotair的慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建

1.2.1 目的基因Hotair獲取 采用改良后的重疊延伸PCR法。按照DNA提取試劑盒說明書，提取正常P0期(出生24 h內(nèi))小鼠的心肌組織DNA，分別設(shè)計(jì)Hotair基因兩段外顯子序列的PCR引物。Hotair外顯子1上游引物(F1)5′-AAAACTGTAATACTCAGACAGACAATTAAGC-3′，下游引物(R1)5′-TGAGCTTATAAGGAAGGAGTCGGTCC-3′；Hotair外顯子2上游引物(F2)5′-TTCCTTATAAGCTCATCGGAGCACGATAG-3′，下游引物(R2)5′-AGATTCACAAACAAGAATTTATTTGCATTTG-3′。以提取的小鼠基因組DNA為模板，按照HiFi酶說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)；分別以F1、R1為引物擴(kuò)增Hotair基因的第一段外顯子序列(452 bp)，以F2、R2為引物擴(kuò)增Hotair基因的第二段外顯子序列(1 777 bp);PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證(圖1A)，并用膠回收試劑盒純化回收產(chǎn)物后備用。再以純化回收后的兩段外顯子序列混合物為模板，以F1、R2為引物進(jìn)行第二次重疊PCR，產(chǎn)物經(jīng)過1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得Hotair基因序列全長(圖1B)，并用膠回收試劑盒純化回收。

注：A為Hotair基因兩段外顯子PCR產(chǎn)物；B為Hotair基因全長PCR產(chǎn)物。

1.2.2 慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建 使用BamH Ⅰ單酶切載體pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro得到線性化載體，膠回收試劑盒純化回收。按照諾唯贊一步克隆試劑盒說明書方案設(shè)計(jì)Hotair基因帶有pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro載體同源臂的PCR引物，上游引物(F3)5′-ATTCGAATTTAAATCGGATCCAAAACTGTAATT-ACTCAGACAGACAATTAAGC-3′，下游引物(R3)5′-ATCCTTCGCGGCCGCGGATCCTGAGCTTATAAGGA-AGGCGTCGGTCC-3′，參照1.2.1，膠回收得到純化的Hotair全長序列，依次為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，1%瓊脂糖凝膠電泳分離，膠回收試劑盒純化回收。按照試劑盒說明書進(jìn)行后續(xù)重組轉(zhuǎn)化，于37 ℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。第2天挑取多個(gè)單克隆菌落于5 mL具有氨芐抗性的液體LB培養(yǎng)基中，置于37 ℃、220 r/min搖床上過夜培養(yǎng)。質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，送金唯智公司測序驗(yàn)證，將測序結(jié)果與Hotair序列(NR_047528.1)在Nocleotide BLAST軟件上進(jìn)行比對。結(jié)果顯示構(gòu)建的慢病毒質(zhì)粒Hotair序列正確(圖2)，證實(shí)目的基因Hotair準(zhǔn)確插入到載體pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro中。

圖2 Hotair基因慢病毒表達(dá)質(zhì)粒的插入序列對比結(jié)果

1.2.3 慢病毒包裝及濃縮純化 采用高分子聚合物轉(zhuǎn)染法。將四個(gè)慢病毒質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染步驟按DNAfectinTMplus轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作。分別于感染后48、72 h收集病毒液，0.45 μm濾膜過濾。配置5×PEG 8000-NaCl母液，包含NaCl 8.766 g、PEG 8000 50 g、超純水200 mL；高壓后4 ℃保存。每30 mL過濾后的病毒上清中，加入5×PEG 8000-NaCl母液7.5 mL；每隔30 min混勻1次液體，置于4 ℃冰箱；重復(fù)操作4次，置于4 ℃冰箱過夜。第2天，4 ℃條件下10 000 r/min離心30 min，棄上清；每管(初始病毒原液為30 mL)加入300 μL預(yù)冷PBS溶解病毒；將病毒分裝后凍存于-80 ℃冰箱備用。

1.3 心肌組織過表達(dá)Hotair的新生小鼠模型建立及驗(yàn)證

1.3.1 動物分組及處理方法 取P0期小鼠18只(體質(zhì)量約2.5 g)，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為Hotair過表達(dá)組、陰性對照組、空白對照組，每組6只。將各組小鼠置于冰上低溫麻醉2 min，Hotair過表達(dá)組于左側(cè)胸腔第五肋間隙注射濃縮后的Hotair慢病毒10 μL，陰性對照組和空白對照組分別注射等量空載病毒和生理鹽水，待其復(fù)溫后放回籠中飼養(yǎng)。各組注射4 d后處死小鼠，取心臟組織，用生理鹽水灌注沖洗后液氮保存。

1.3.2 心肌組織Hotair、賴氨酸特異性去甲基化酶1(LSD1) mRNA表達(dá)檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。取出各組液氮凍存的小鼠心臟組織，按RNAiso plus說明書操作提取總RNA。以Random primer為引物，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。按照EVA Green Master Mix說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR引物序列：Hotair上游引物5′-CAGAAGACACGCACGGAGAA-3′，下游引物5′-ATGACTGGTCCTCTTCCGGT-3′；LSD1上游引物5′-CGACTTCCCCATGACCGAAT-3′，下游引物5′-GAGTGGCTTCAAACGTCAGC-3′；β-actin上游引物5′-ACCTTCTACAATGAGCTTGCG-3′，下游引物5′-CTGGATGGCTACGTACATGG-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火40 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算Hotair、LSD1 mRNA相對表達(dá)量。

1.3.3 心肌組織H3K4me2蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。取出各組液氮凍存的小鼠心臟組織，剪碎后加入500 μL含有蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液，反復(fù)渦旋、冰浴后離心吸取上清液，按照BCA試劑盒說明書測定蛋白濃度。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉；分別加入H3、H3K4me2一抗(稀釋比例分別為1∶2 000、1∶1 000)，4 ℃孵育過夜；洗膜后加入二抗(山羊抗兔抗體，稀釋比例1∶1 000)，室溫孵育1 h；再次洗膜后加入ECL發(fā)光液進(jìn)行曝光，利用Image J軟件分析灰度值。以H3作為內(nèi)參，計(jì)算H3K4me2蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

Hotair過表達(dá)組心肌組織Hotair表達(dá)高于陰性對照組和空白對照組，H3K4me2蛋白表達(dá)低于陰性對照組和空白對照組(P均<0.01)。Hotair過表達(dá)組與陰性對照組心肌組織LSD1 mRNA相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1、圖3。

表1 各組心肌組織Hotair、LSD1 mRNA及H3K4me2蛋白表達(dá)比較

圖3 各組心肌組織H3K4me2蛋白表達(dá)情況(Western blotting法)

3 討論

盡管現(xiàn)有的醫(yī)療手段不斷在提升，能夠有效控制心血管疾病的進(jìn)展并改善患者預(yù)后，但人類心肌細(xì)胞的不可再生性是心血管系統(tǒng)疾病難以治愈的主要原因。長期以來，成年哺乳動物的心肌細(xì)胞一直被認(rèn)為是無法再生的。2011年P(guān)orrello等[8]研究發(fā)現(xiàn)，新生小鼠的心臟組織受到損傷(心肌梗死或者部分心尖切除)后，可以刺激心肌細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)大的再生潛能，這種再生能力在出生7 d后便喪失。近年來，新生小鼠心肌細(xì)胞的這種短暫的再生時(shí)間窗受到醫(yī)學(xué)界廣泛關(guān)注。研究表明，適當(dāng)?shù)难装Y刺激和低氧環(huán)境有利于促進(jìn)心肌細(xì)胞再生，且許多信號分子、轉(zhuǎn)錄因子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑均參與調(diào)控哺乳動物心肌細(xì)胞的增殖[9,10]。Meis1是一種轉(zhuǎn)錄因子，參與介導(dǎo)心肌細(xì)胞周期停滯的調(diào)控[11]；Ponnusamy等[12]發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的LncRNA，并命名為CPR(被認(rèn)為是一種心肌細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)劑)，其研究結(jié)果表明CPR高表達(dá)與哺乳動物出生后及成年后心肌細(xì)胞增殖能力減弱密切相關(guān)。但目前為止，關(guān)于LncRNA參與調(diào)控心肌細(xì)胞增殖的信號通路研究甚少。

Hotair與多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，現(xiàn)被認(rèn)為是預(yù)測多種癌癥患者預(yù)后、癌癥復(fù)發(fā)、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移預(yù)后的潛在指標(biāo)[13]。在心血管系統(tǒng)中，Hotair過表達(dá)能夠抑制炎癥引起的心肌細(xì)胞凋亡[14,15]；在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的小鼠糖尿病性心肌病模型中，Hotair能夠抑制心肌纖維化[7]；在膿毒癥小鼠心肌細(xì)胞中，Hotair表達(dá)明顯上調(diào)，Hotair被認(rèn)為是心血管疾病進(jìn)展的重要調(diào)節(jié)因子[16]。LncRNA與多種細(xì)胞功能有關(guān)，其中大多數(shù)功能需要與一種或多種RNA結(jié)合蛋白(RBP)相互作用，部分LncRNA可以通過組蛋白修飾在表觀遺傳學(xué)上調(diào)控基因表達(dá)。Hotair在心血管疾病中的相關(guān)研究大多是細(xì)胞水平的，眾多作用機(jī)制尚未在動物中得到驗(yàn)證。因此，有必要建立一種便捷易操作的、在心臟組織過表達(dá)Hotair基因的動物模型，以便進(jìn)一步研究Hotair對各器官及系統(tǒng)的影響。

本研究對傳統(tǒng)的重疊延伸PCR技術(shù)進(jìn)行改良，從小鼠基因組中獲取Hotair基因。重疊延伸PCR技術(shù)是指在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，采用具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈，通過重疊鏈的延伸，將不同來源的基因片段拼接起來的技術(shù)[17]。Cha-Aim等[18]研究表明，即使重疊序列短于15個(gè)核苷酸，該序列也可以產(chǎn)生可靠而且可重復(fù)的結(jié)果。Hotair第一段外顯子的3′端和第二段外顯子的5′端有7個(gè)核苷酸的同源序列，因此本研究利用其自身存在的同源臂，以兩段外顯子為模板，以第一段外顯子的上游引物和第二段外顯子的下游引物為本次擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR，產(chǎn)物即為Hotair基因全長序列。相比傳統(tǒng)的重疊延伸PCR技術(shù)，改良后的重疊延伸PCR技術(shù)可以更加便捷有效地?cái)U(kuò)增目的基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠且操作可重復(fù)。

動物體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染病毒載體有腺病毒、慢病毒和腺相關(guān)病毒。腺病毒因其包裝滴度高、可插入片段大、瞬時(shí)表達(dá)能力強(qiáng)和在體內(nèi)表達(dá)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于動物基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中。腺相關(guān)病毒具有免疫原性極低、多血清型和相對組織親和性高等特點(diǎn)，是比較理想的動物體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染工具。但是腺病毒和腺相關(guān)病毒包裝技術(shù)繁瑣，時(shí)間較久，費(fèi)用昂貴。此外，與腺病毒載體實(shí)現(xiàn)的瞬時(shí)表達(dá)不同，慢病毒具有有效的整合機(jī)制，可引起靶細(xì)胞中穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因表達(dá)[19,20]。相比前兩種病毒，慢病毒是來自逆轉(zhuǎn)錄病毒科的單鏈RNA病毒，能感染分裂和非分裂細(xì)胞，因而作為基因遞送載體被廣泛應(yīng)用。慢病毒包裝簡單易操作，濃縮和純化過程也省時(shí)省力，經(jīng)濟(jì)成本低。本研究首次應(yīng)用慢病毒載體介導(dǎo)的Hotair經(jīng)胸腔注射轉(zhuǎn)染新生小鼠心肌細(xì)胞，成功實(shí)現(xiàn)了Hotair在心肌組織的過表達(dá)，且該方法操作相對簡便、經(jīng)濟(jì)，在病毒感染后第4天即可獲得理想的動物模型。

Hotair公認(rèn)的分子機(jī)制一方面是作為miRNA海綿來抑制miRNA的靶效應(yīng)[12]，一方面則通過表觀遺傳學(xué)作用，Hotair的3′端結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合LSD1/CoREST/REST復(fù)合物，協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)H3K4me2到H3K4me1的去甲基化[21]。LSD1是一種黃素依賴性單胺氧化酶，是組蛋白H3的特異性去甲基化酶，可通過脫去組蛋白H3單甲基化或二甲基化的賴氨酸4(K4me1/K4me2)或賴氨酸9(K9me1/K9me2)的甲基來調(diào)控靶基因表達(dá)[22]。本研究結(jié)果顯示，小鼠心肌組織過表達(dá)Hotair后并不影響其LSD1 mRNA表達(dá)，但Hotair過表達(dá)會導(dǎo)致H3K4me2蛋白表達(dá)明顯降低，說明Hotair過表達(dá)明顯增強(qiáng)了LSD1的去甲基化功能。LSD1能夠使結(jié)合在靶基因啟動子區(qū)域的H3K4me2去甲基化，從而抑制或者激活靶基因的轉(zhuǎn)錄[23]。通過過表達(dá)Hotair能夠增強(qiáng)LSD1對H3K4me2的去甲基活性，進(jìn)一步驗(yàn)證本研究Hotair過表達(dá)動物模型構(gòu)建成功，并且Hotair過表達(dá)后能夠穩(wěn)定發(fā)揮其功能。

綜上所述，本研究成功應(yīng)用慢病毒載體建立心肌組織穩(wěn)定過表達(dá)Hotair的新生小鼠模型，該模型構(gòu)建方法簡便快捷，病毒感染后第4天即可檢測到目的基因穩(wěn)定表達(dá)，且Hotair過表達(dá)效果明顯，能夠顯著增強(qiáng)LSD1對H3K4me2的去甲基活性，為后續(xù)研究Hotair參與心臟疾病的相關(guān)機(jī)制提供了可靠的動物模型。