李曉杰，覃瑛，周誼霞,2

1貴州醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院，貴陽550004；2貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院

動脈粥樣硬化是心血管疾病致死率、致殘率最高的危險因素之一，是缺血性腦卒中、動脈粥樣硬化性心臟病、外周血管疾病的主要發(fā)病原因[1]。因此，防治動脈粥樣硬化是預(yù)防心血管病變惡化的重要手段。動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制涉及內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞以及平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞的參與，其中平滑肌細(xì)胞增殖、遷移、去分化是促進(jìn)動脈粥樣硬化發(fā)生的一個關(guān)鍵因素[2]。在正常健康人群中，血管平滑肌細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)[3]；當(dāng)遇到炎癥、脂質(zhì)含量增多、機(jī)械性損傷時，血管平滑肌細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，從血管中膜向血管內(nèi)膜遷移并分泌細(xì)胞外基質(zhì)，使新生血管增多，從而促進(jìn)了動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展[4]。因此研究血管平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移對于防治心血管疾病的意義重大。2019年9～12月，本研究建立了一種穩(wěn)定、可靠的敘利亞金黃地鼠主動脈血管平滑肌細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，以期為動脈粥樣硬化的基礎(chǔ)研究提供可靠的細(xì)胞來源?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物： 3～4周齡雄性敘利亞金黃地鼠2只，體質(zhì)量40～60 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學(xué)動物房[動物使用許可證號：SYXK(黔)2018-0001]。主要試劑：DMEM/F12、青霉素和鏈霉素、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司，特級胎牛血清購自美國Clark公司，PBS購自武漢賽維爾生物科技有限公司；平滑肌肌動蛋白α(α-SMA)、平滑肌22α(SM22α)一抗均購自武漢三鷹生物科技有限公司，熒光二抗購自泰安普美生物科技有限公司；含DAPI抗熒光淬滅封片劑購自上海翊圣生物科技有限公司，CCK-8試劑盒購自日本東仁化學(xué)科技有限公司。

1.2 血管平滑肌細(xì)胞分離及原代培養(yǎng) 選取敘利亞金黃地鼠2只，采用5%水合氯醛按0.65 mL/kg體質(zhì)量腹腔注射麻醉。麻醉后將敘利亞金黃地鼠固定在固定器上，75%乙醇全身消毒，無菌條件下用手術(shù)剪縱向剖開外部皮膚至頸部，用彎鑷鈍性分離兩側(cè)皮膚，暴露腹部。換另一把無菌剪刀，剪開內(nèi)部肌層，充分暴露內(nèi)臟。剪開膈肌，小心暴露心臟，止血鉗夾住劍突向上翻，充分暴露胸腔；翻開左肺，可見主動脈沿肺根部緊貼脊柱向下走行。用眼科彎鑷夾住主動脈弓，眼科剪緊貼脊柱從主動脈弓部剪至腹主動脈。將主動脈放入盛有DMEM/F12培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，漂洗血管內(nèi)外的血凝塊；將血管轉(zhuǎn)移到第2個盛有DMEM/F12培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，眼科彎鑷小心剝?nèi)パ芡饽ず椭車Y(jié)締組織；再將血管轉(zhuǎn)移至另一干凈培養(yǎng)皿中，小心縱向剖開血管，用眼科彎鑷輕輕刮掉內(nèi)膜；將血管剪成約1 mm3的小塊，均勻鋪展于25 cm2培養(yǎng)平底。翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)，靜置2 h。待組織塊稍微干涸、緊貼培養(yǎng)瓶底部后，緩慢加入含10%胎牛血清、1%雙抗(青霉素、鏈霉素)、89% DMEM/F12的完全培養(yǎng)基4 mL。輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)基完全浸沒培養(yǎng)瓶底部的組織塊，繼續(xù)置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。前3 d絕對靜置培養(yǎng)，第3天換液，以后每隔2 d換液1次。

1.3 血管平滑肌細(xì)胞傳代培養(yǎng) 待細(xì)胞融合80%時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。吸去培養(yǎng)基，PBS漂洗3次，加入0.25%胰蛋白酶1 mL，放入37 ℃培養(yǎng)箱中消化30 s。顯微鏡下觀察細(xì)胞皺縮變圓、細(xì)胞間隙變大、輕拍培養(yǎng)瓶時大部分細(xì)胞從培養(yǎng)瓶底脫落時，加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止消化。用1 mL槍頭輕輕吹打成細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移到15 mL無菌無酶離心管內(nèi)，室溫下以1 000 r/min離心5 min。棄掉上清，加入3 mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以1∶3的比例進(jìn)行細(xì)胞傳代，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

1.4 血管平滑肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 取原代培養(yǎng)3 d后的細(xì)胞及前3代傳代細(xì)胞，200倍倒置相差顯微鏡下觀察血管平滑肌細(xì)胞的大小、形態(tài)、排列規(guī)律以及生長特點。

1.5 血管平滑肌細(xì)胞鑒定 采用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)。取第3代對數(shù)生長期的血管平滑肌細(xì)胞，以5×103/孔接種于鋪有爬片的12孔板中。待細(xì)胞長至70%時，棄去孔板中的培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS漂洗3次。4%多聚甲醛固定15 min(此操作完成后可-20 ℃保存)。PBS漂洗5 min×3次，0.3% Triton通透細(xì)胞，室溫靜置15 min。每孔加入10%山羊血清400 μL，室溫封閉2 h，PBS漂洗5 min×3次。加入平滑肌細(xì)胞特異性標(biāo)志因子α-SMA、SM22α一抗，4 ℃孵育過夜;0.3% Triton漂洗5 min×3次，PBS漂洗5 min×1次。加入二抗室溫避光孵育1 h，0.3% Triton漂洗5 min×3次，PBS漂洗5 min×1次。用含DAPI的封片劑封片，200倍熒光倒置顯微鏡下拍照觀察。

1.6 血管平滑肌細(xì)胞增殖能力觀察 采用CCK-8法。取第3代消化好的血管平滑肌細(xì)胞懸液，以5×102/孔接種于96孔板，孔板最外圍所有孔加入PBS 100 μL，防止蒸發(fā)影響外周細(xì)胞生長。每天相同時間點進(jìn)行CCK-8檢測，每100 μL培養(yǎng)基加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h。采用酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處的光密度(OD)值，連續(xù)檢測7 d。每組設(shè)置6個復(fù)孔，另設(shè)一組沒有細(xì)胞只有培養(yǎng)基的空白對照組。

2 結(jié)果

2.1 原代與傳代血管平滑肌細(xì)胞形態(tài)特征觀察結(jié)果 原代培養(yǎng)3～5 d，有少量血管平滑肌細(xì)胞從組織中爬出，呈貼壁生長；原代培養(yǎng)7～9 d，細(xì)胞呈梭形或三角形，生長力旺盛，折光度好；原代培養(yǎng)9 d后，細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)，細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞與細(xì)胞間排列緊密，出現(xiàn)“峰-谷”狀特征；原代培養(yǎng)15 d左右可以進(jìn)行傳代培養(yǎng)。前3代傳代細(xì)胞與原代細(xì)胞相比，形態(tài)無明顯變化。

2.2 血管平滑肌細(xì)胞鑒定結(jié)果 熒光倒置顯微鏡下可見DAPI將細(xì)胞核染成藍(lán)色，α-SMA、SM22α將細(xì)胞質(zhì)染成綠色，血管平滑肌細(xì)胞純度>95%；被α-SMA、SM22α綠染的細(xì)胞質(zhì)中有大量平行于細(xì)胞長軸的肌絲。見圖1。

注：A為α-SMA免疫熒光鑒定結(jié)果，B為SM22α免疫熒光鑒定結(jié)果。

2.3 血管平滑肌細(xì)胞增殖能力檢測結(jié)果 血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)1～7 d的OD值分別為0.437 3±0.021 5、0.460 0±0.018 8、0.614 3±0.022 5、0.845 3±0.027 4、0.862 5±0.024 0、0.828 0±0.027 1、0.816 0±0.020 2。見圖2。

3 討論

大鼠和小鼠由于成本低、易飼養(yǎng)，之前多被研究者作為動脈粥樣硬化的首選動物模型。但是隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)大鼠糖脂代謝機(jī)制與人類相差較大[5]，而小鼠存在一次性采血量少且不能連續(xù)采血的缺點[6]。敘利亞金黃地鼠屬于嚙齒類動物，體型介于大鼠和小鼠之間，在1930年從中東敘利亞引進(jìn)[7]。研究表明，與大鼠、小鼠比較，敘利亞金黃地鼠血漿脂蛋白譜、肝臟合成膽固醇速率以及膳食膽固醇需要量和代謝率與人類更為相似[8～11]。因此，將敘利亞金黃地鼠作為高血脂、動脈粥樣硬化、糖尿病等以糖脂代謝紊亂為特征的心血管病動物模型已成為一種趨勢。為了深入研究上述心血管疾病的發(fā)病機(jī)制，體外培養(yǎng)穩(wěn)定的敘利亞金黃地鼠血管平滑肌細(xì)胞模型也逐漸成為研究熱點。

圖2 敘利亞金黃地鼠第3代血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)7 d的生長曲線(CCK-8法)

既往小鼠血管平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)常采用酶消化法[12～14]，該方法價格昂貴且消化時間和配比濃度不好把控，有可能導(dǎo)致細(xì)胞獲得量少、活性差等。因此，本研究選擇組織塊貼壁法[15]提取敘利亞金黃地鼠主動脈血管平滑肌細(xì)胞。在原代細(xì)胞的提取過程中，需將心血管外膜剝離干凈，刮去內(nèi)膜，以避免內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的污染，確保原代血管平滑肌細(xì)胞的純度。本研究結(jié)果顯示，分離提取的血管平滑肌細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及細(xì)胞免疫熒光鑒定，血管平滑肌細(xì)胞純度>95%；傳代的血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)1 d時處于增殖潛伏期，細(xì)胞增長緩慢；2～4 d處于對數(shù)生長期，增殖能力最強(qiáng)；5～7 d處于平臺期，細(xì)胞出現(xiàn)生長抑制的現(xiàn)象，增殖能力開始降低。因此，本研究提取的血管平滑肌細(xì)胞傳代后2～4 d是進(jìn)行后續(xù)實驗的最佳時期。

在細(xì)胞分離與培養(yǎng)過程中，為了提高血管平滑肌細(xì)胞的獲得率和純度，需注意以下幾點：①選取健康的年輕敘利亞金黃地鼠(3～4周齡為宜)，年齡越小，原代細(xì)胞越容易從組織塊中爬出，細(xì)胞活性和增殖能力也越好，即使在傳代次數(shù)多的情況下，也能保證血管平滑肌細(xì)胞的穩(wěn)定性。②為了防止污染，全程應(yīng)注意無菌操作，所使用的器械均應(yīng)高壓滅菌后在超凈工作臺打開使用。③為提高血管平滑肌細(xì)胞的活性，在分離外膜時，應(yīng)輕輕擠掉血管腔內(nèi)的血凝塊，不可過度牽拉血管；剪組織的剪刀要盡可能鋒利，使組織塊邊緣平整，大小以1 mm×1 mm為宜；若組織塊不平整或體積過大，會導(dǎo)致細(xì)胞爬出困難，原代培養(yǎng)失敗；為避免細(xì)胞生長緩慢，組織塊在培養(yǎng)瓶底部排列不可太過稀疏，也不可太過緊密，防止接觸抑制現(xiàn)象的發(fā)生。④把組織塊剪碎前要先將組織塊稍微瀝干，盡量減少組織塊在無培養(yǎng)液環(huán)境中的暴露時間，有利于組織更好地貼壁。⑤注意把握培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)的時間，當(dāng)組織塊緊貼培養(yǎng)瓶后再翻轉(zhuǎn)，但若翻轉(zhuǎn)時間過晚，會影響細(xì)胞爬出時間；翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶時動作要輕，緩慢地將培養(yǎng)基沒過組織塊，避免組織塊貼壁不牢而漂浮起來。⑥原代培養(yǎng)前3 d要絕對靜置，不用換液。

綜上所述，本研究成功采用組織塊貼壁法分離培養(yǎng)出敘利亞金黃地鼠原代血管平滑肌細(xì)胞，并通過免疫熒光技術(shù)進(jìn)行鑒定，為動脈粥樣硬化等心血管相關(guān)疾病的基礎(chǔ)研究提供可靠的細(xì)胞來源;細(xì)胞傳代后2～4 d處于對數(shù)生長期,是進(jìn)行后續(xù)實驗的最佳時期。