王嵐琦 楊夢波 王孝盼 鞠 強

1上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院皮膚科，上海，200127；2上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院皮膚科，上海，200025

CCL20是CC亞族的趨化因子，曾被稱為“巨噬細胞炎癥蛋白3α”(macrophage inflammation protein 3α, MIP3α)。人體內的多種組織和細胞均可表達CCL20，正常人皮膚中，角質形成細胞(keratinocyte, KC)極少量地組成性表達CCL20。CCL20具有招募表達其特異性配體CCR6的細胞聚集在上皮組織的作用。不成熟的樹突狀細胞和外周血中Th17細胞表面表達CCR6，被CCL20招募聚集至皮膚中發(fā)揮作用[1]。銀屑病患者的皮損中，CCL20有免疫監(jiān)視功能，其高表達時顯示過強的“免疫監(jiān)視”和皮膚屏障的破壞，并且與病情成平行關系。銀屑病皮損處高表達的白介素(interleukin, IL)1β、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF-α)、IL-17均強有力地刺激CCL20的表達[2]?？ú慈际蔷S生素D衍生物，具有調節(jié)T細胞分化[3]和巨噬細胞活化的作用[4]，參與調節(jié)免疫反應。目前已知卡泊三醇可以調節(jié)銀屑病患者外周血和皮損處Th17細胞遷移[5]，但卡泊三醇調節(jié)KC中CCL20表達的相關性研究報道仍較少。為此，我們探討卡泊三醇對于KC中CCL20的表達及下游相關信號通路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 重組人TNF-α蛋白, CCL20酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒均購自R&D公司；PBS，DMEM培養(yǎng)基，胰酶，胎牛血清，無血清培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；Trizol RNA提取試劑(美國Invitrogen公司)，反轉錄酶試劑盒(日本TaKaRa公司)，實時熒光定量PCR試劑盒(美國BioRad公司)；卡泊三醇，SB202190, SP600125, U0126, CAPE(美國Sigma公司)。兔抗人p-p38, p38，p-ERK, ERK，p-p65, p65, β-tubulin一抗(美國CST公司)，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(美國CST公司)，BCA蛋白分析試劑盒(美國Thermo公司)，化學發(fā)光試劑盒(美國BioRad公司)。

1.2 細胞培養(yǎng) 人原代角質形成細胞由上海交通大學免疫所李寧麗教授惠贈，5～9代細胞用于實驗。無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)人原代角質形成細胞，添加5%牛下丘腦提取物，5 ng/mL人重組表皮生長因子。細胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，每兩天更換1次培養(yǎng)液。待培養(yǎng)皿中細胞覆蓋皿底70%～80%融合時，用胰酶消化傳代。

1.3 細胞刺激 角質形成細胞接種于12孔板(1×105細胞/孔)。待細胞長至70%～80%融合，分別應用TNF-α(10 ng/mL)，卡泊三醇(10/100/1000 nM)，TNF-α+卡泊三醇，TNF-α+卡泊三醇+SB202190(1 μM)，TNF-α+卡泊三醇+SP600125(1 μM)，TNF-α+卡泊三醇+U0126(1 μM)，TNF-α+卡泊三醇+CAPE(1 μM)刺激。SB202190, SP600125, U0126，CAPE預刺激1 h后加入卡泊三醇刺激1 h，隨后加入TNF-α。DMSO作為對照組。

1.4 實時熒光定量PCR檢測細胞中CCL20mRNA水平 TRIzol提取人原代角質形成細胞中RNA，使用TaKaRa試劑盒按照說明書逆轉錄獲得cDNA，檢測基因及引物序列見表1，GAPDH作為內參。

表1 實時熒光定量PCR檢測基因及引物序列(5’-3’)

1.5 ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液中CCL20分泌量 將原代人角質形成細胞接種于96孔板中(2×104/孔)，刺激同上，24 h后收集細胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書操作檢測，并設定空白對照孔，酶標儀檢測450 nm處吸光度。根據標準曲線計算樣本濃度。

1.6 Western印跡檢測細胞中p38，ERK，NF-κBp65磷酸化水平 將人角質形成細胞接種于12孔板中(2.5×105個/孔)，24 h后待細胞融合度達到80%以上時，卡泊三醇1000 nM預刺激1 h，隨后給予10 ng/mL TNF-α刺激，繼續(xù)培養(yǎng)15/30/60 min后，RIPA裂解液提取總蛋白，刮下細胞并轉移至1.5 mL微量離心管中，冰上裂解30 min，使蛋白充分裂解，10000 g離心5 min，吸取上清液留存，棄沉淀。BCA試劑盒測定蛋白濃度，調整蛋白濃度，加入5×十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白上樣緩沖液，煮沸變性。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將分離后的蛋白轉至聚偏二氟乙烯膜上，封閉液封閉1 h，TBST洗膜3次，每次5 min。加入兔抗人p-p38、p-ERK、p-p65、p38、ERK、p65一抗，4℃孵育過夜，加人羊抗兔二抗室溫孵育1 h，化學發(fā)光系統(tǒng)ECL試劑盒顯影成像。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23軟件分析數據，結果以均數±標準差表示，每個實驗重復3次，3組間指標的比較采用單因素方差分析，并采用LSD校正進行兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。采用Graphpad軟件制圖。

2 結果

2.1 卡泊三醇抑制TNF-α誘導KCs中CCL20的表達 同TNF-α 組相比，卡泊三醇(100 nM)抑制CCL20mRNA表達(P<0.001)，見圖1a，卡泊三醇刺激細胞3 h或6 h后，細胞中CCL20mRNA表達量下降。卡泊三醇抑制CCL20的蛋白表達，并且呈劑量相關(P<0.001)，見圖1b。

1a：卡泊三醇(100 nM)預刺激人原代角質形成細胞1 h，隨后給予TNF-α(10 ng/mL)刺激人原代角質形成細胞3 h，Q-PCR檢測CCL20mRNA的表達；1b：卡泊三醇(10/100/1000 nM)預刺激人原代角質形成細胞1 h，隨后給予TNF-α(10 ng/mL)刺激人原代角質形成細胞24小時，ELISA檢測CCL20蛋白的表達。*：P<0.1,**：P<0.01,***：P<0.001，NS：no significance

2.2 MAPKs和NF-κB通路參與TNF-α 誘導CCL20的表達 使用MAKPs和NF-κB通路抑制劑(p38抑制劑：SB202190；JNK抑制劑：SP600125；ERK抑制劑：U0126；NF-κB抑制劑：CAPE)預刺激KCs，觀察TNF-α 刺激后CCL20 mRNA表達。同對照組相比，CCL20 mRNA的表達在p38抑制劑組(P=0.003)和NF-κB抑制劑組下降(P=0.006)。ERK抑制劑作用后，CCL20 mRNA的表達增加(P=0.009)。JNK抑制劑作用后CCL20 mRNA的表達變化無統(tǒng)計學差異(P=0.102)，見圖2a。在TNF-α 刺激15 min后，p38、ERK、NF-κBp65磷酸化加強(圖2b)。

NS：no significance;SB：SB202190;SP：SP600125 ns：not significant;con：空白對照;SB：SB202190;SP：SP600125;Cal：卡泊三醇

2.3 MAPKs參與卡泊三醇抑制TNF-α誘導CCL20 卡泊三醇抑制了TNF-α誘導的KC中p38、ERK、NF-κBp65磷酸化(圖3a)。MAPKs和NF-κB抑制劑預刺激后，使用TNF-α(10 ng/mL)和卡泊三醇(1000 nM)共刺激KC，CCL20表達在p38抑制劑組下降(P=0.048)，而ERK抑制劑促進CCL20表達(P=0.002)。JNK和NF-κB抑制劑對于卡泊三醇和TNF-α共刺激組的CCL20表達無影響(JNK抑制劑組，P=0.206；NF-κB抑制劑組，P=0.290)，見圖3b。

3 討論

銀屑病是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，其發(fā)病率在高加索人群為2%。銀屑病主要病理表現為角質形成細胞(keratinocyte，KC)增生，角化不全，真皮內炎癥細胞浸潤[6]。目前銀屑病的發(fā)病機制還沒有定論，但越來越多的研究表明皮膚屏障功能受損[6]及白介素(IL)-23/Th17軸和Th17相關的細胞因子在疾病的發(fā)生、發(fā)展中起關鍵作用[7，8]。銀屑病患者KC高表達病原體識別受體(pattern recognition receptors, PRR)，外界病原相關分子模式通過PRR活化天然免疫系統(tǒng)，誘發(fā)皮膚炎癥[9，10]。同時壞死的KC釋放的損傷相關分子活化天然免疫系統(tǒng)，促進皮膚炎癥[11]。皮膚屏障破壞后外界有害刺激和皮膚共生菌直接進入真皮被樹突狀細胞識別，遞呈細菌抗原，活化適應性免疫系統(tǒng)，招募免疫細胞聚集在皮膚，誘發(fā)炎癥[12]。同正常人相比，銀屑病患者皮損中Th17細胞，γδ T細胞數量顯著增多，這些細胞在患者的外周血中卻少于正常對照者[13，14]，提示這些產生IL-17的細胞在疾病過程中存在著重新分布，即從外周游向皮膚。Th17細胞，γδ T細胞通過表面表達的趨化因子受體CCR6靶向皮膚遷移聚集[13，14]。CCL20是CCR6在體內的唯一配體，其在皮膚中主要來源于KC[1]。Th17細胞，γδ T細胞活化后分泌下游效應分子，如IL-17A、IL-17F、IL-22和TNF-α[13，15]。其中TNF-α調節(jié)皮膚抗菌肽(包括β-防御素和S100A家族)的表達[16]，下調filaggrin和黏附分子表達，導致皮膚屏障破壞[17]。TNF-α促進促炎因子(IL-6，IL-1β)和趨化因子(CXCL8，CCL20)在皮膚中的表達，引起局部炎癥反應[1，18]。FDA批準了TNF-α單克隆抗體用于治療中度至重度銀屑病。多中心研究顯示TNF-α單克隆抗體可以有效改善患者生活質量及癥狀[19]。

卡泊三醇是維生素D衍生物，能夠誘導角質細胞的分化、抑制其增殖、調節(jié)免疫功能并減輕炎癥，是治療銀屑病的一線藥物?？ú慈伎梢哉{節(jié)T細胞遷移[20]，銀屑病患者使用卡泊三醇治療后皮損中Th17數量下降[5]?？ú慈紝τ谘装Y的調節(jié)在不同細胞中呈現不同結果。有研究顯示骨化三醇抑制類風濕滑膜成纖維細胞中TNF-α誘導的CCL20的表達。而在關節(jié)軟骨細胞中，骨化三醇加強了TNF-α誘導的CCL20的表達[21]。而在人角質形成細胞中，我們的研究顯示卡泊三醇抑制TNF-α誘導的CCL20表達，這可以解釋銀屑病患者接受卡泊三醇治療后皮損中Th17和γδ T細胞數量下降[5]。

MAPKs和NF-κB是炎癥反應相關的重要信號通路。在不同表皮細胞系中，TNF-α可以活化MAPKs和NF-κB通路。在呼吸道上皮中，TNF-α通過p38和ERK通路促進CCL20的產生[22]；在腸道上皮中，TNF-α通過p38途徑促進CCL20的表達[23]。我們的研究顯示TNF-α誘導人KCs中ERK，p38，NF-κBp65的磷酸化，參與CCL20的表達，而JNK通路在其中不起作用。有趣的是，不同于尋常MAPKs活化促進炎癥反應，我們研究顯示使用ERK抑制劑后，CCL20的表達進一步上升，表明ERK的活化抑制CCL20的表達。在卡泊三醇抑制TNF-α誘導的CCL20過程中，NF-κB、ERK、p38MAPK均參與此過程?？ú慈纪ㄟ^抑制NF-κB p65，p38MAPK磷酸化，抑制CCL20的表達。在圖3b中顯示NF-κB和JNK抑制劑對于卡泊三醇和TNF-α共刺激組的CCL20表達無影響，我們認為這兩組的發(fā)生機制有所不同。我們的研究結果顯示NF-κB參與TNF-α誘導CCL20產生的過程(圖2b)，卡泊三醇抑制NF-κB p65亞單位的磷酸化(圖3a)，因此再加入NF-κB抑制劑不會影響卡泊三醇和TNF-α共刺激組的CCL20表達，這說明NF-κB是卡泊三醇的下游信號通路。而JNK不參與TNF-a誘導CCL20產生的過程，因此使用了JNK抑制劑后，下游CCL20的表達量無改變。綜上所述，我們發(fā)現TNF-α促進KCs產生趨化因子CCL20，而卡泊三醇能夠顯著抑制CCL20表達，NF-κB, ERK，p38MAPK參與此過程。