茹慧波，董九華，王琇，張亦心，杜麗榮

(河北省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究院 國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)計(jì)劃生育與優(yōu)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河北省生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊 050071)

促性腺激素釋放激素拮抗劑方案(拮抗劑方案)在輔助生殖技術(shù)(ART)的臨床實(shí)踐中以其周期治療時(shí)間短、符合生理過程的優(yōu)勢(shì)在控制性促排卵中受到重視[1]。雖然有Meta分析認(rèn)為拮抗劑方案與激動(dòng)劑長(zhǎng)方案的妊娠結(jié)局基本一致，但還有不少研究認(rèn)為兩者間存在一定差異[2]。近年臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)拮抗劑方案新鮮周期移植的著床率和妊娠率均低于激動(dòng)劑方案[3]，因此臨床上準(zhǔn)備鮮胚移植的患者會(huì)避免采用拮抗劑方案，而采用拮抗劑方案促排卵的患者往往會(huì)行全胚冷凍后再解凍移植。研究證實(shí)，當(dāng)獲卵數(shù)小于15枚時(shí)，全胚冷凍后解凍移植的臨床結(jié)局并不優(yōu)于新鮮周期移植[4]。此外，實(shí)施全胚冷凍+凍融胚胎移植(FET)不僅延長(zhǎng)了患者獲得妊娠的時(shí)間，增加患者的焦慮情緒，而且增加了FET周期的經(jīng)濟(jì)費(fèi)用。因此，如何提高拮抗劑方案鮮胚移植妊娠率是現(xiàn)在研究熱點(diǎn)之一。粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)是正常妊娠生理過程中調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞功能的重要細(xì)胞因子之一，在母胎界面有著重要的調(diào)節(jié)作用。研究已證明G-CSF可參與調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜血管重塑、局部免疫調(diào)控及細(xì)胞粘附系統(tǒng)，調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性，包括子宮內(nèi)膜厚度、腔上皮、腺上皮、間質(zhì)的發(fā)育狀態(tài)及子宮內(nèi)膜的血流灌注情況[5]。研究發(fā)現(xiàn)G-CSF可以提高反復(fù)移植失敗IVF患者的妊娠率[6]。本研究旨在探討拮抗劑方案鮮胚移植患者移植時(shí)使用G-CSF能否改善其妊娠結(jié)局。

資料及方法

一、研究對(duì)象及分組

本研究經(jīng)河北省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究院倫理委員會(huì)審批通過后，招募2018年1月至2019年10月于我院采用拮抗劑方案行IVF-ET治療的患者，嚴(yán)格按照納入和排除標(biāo)準(zhǔn)篩選，經(jīng)與患者充分溝通討論實(shí)驗(yàn)對(duì)妊娠率的影響和藥物可能的副作用等，患者夫婦知情同意并簽署相關(guān)知情同意書后，采用完全隨機(jī)分組研究的方法和要求，按照SPSS軟件提供的完全隨機(jī)數(shù)字表，遵循完全隨機(jī)原則分配為治療組和對(duì)照組，每組各50例。

納入標(biāo)準(zhǔn)：20～40歲不孕患者；促排卵方案為拮抗劑方案；新鮮周期移植。

排除標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)G-CSF過敏者以及對(duì)大腸桿菌表達(dá)的其他制劑過敏者；既往惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病病史者，尤其是骨髓中幼稚粒細(xì)胞未顯著減少的骨髓性白血病或外周血中檢出幼稚粒細(xì)胞的骨髓性白血病。

二、研究方法

1.輔助生殖治療：采用靈活GnRH拮抗劑方案促排卵，于月經(jīng)第2～3天進(jìn)周期，促性腺激素(Gn)初始量依年齡、基礎(chǔ)激素水平、基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)、抗苗勒管激素(AMH)水平、體重指數(shù)(BMI)及既往促排結(jié)局等綜合評(píng)價(jià)，啟動(dòng)量為150～300 U/d，視卵泡發(fā)育情況及血FSH、LH、E2、P水平及時(shí)調(diào)整Gn的用量和卵泡監(jiān)測(cè)時(shí)間；B超監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)有1個(gè)以上卵泡直徑達(dá)到14 mm或者LH≥4 U/L或者E2≥1 500 pmol/L時(shí)開始加用注射用醋酸西曲瑞克(思則凱，默克雪蘭諾，法國(guó))0.125～0.25 mg，直至扳機(jī)日。當(dāng)1～2個(gè)主導(dǎo)卵泡平均直徑≥18～20 mm或>16 mm主導(dǎo)卵泡占比大于60%時(shí)，使用重組HCG(艾澤，默克雪蘭諾，西班牙)250 μg 聯(lián)合HCG(珠海麗珠醫(yī)藥)2 000～5 000 U扳機(jī)，36 h后經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下穿刺取卵。移植前行胚胎質(zhì)量評(píng)分，按照胚胎標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分選取1～2枚第3天卵裂期胚胎進(jìn)行移植，且至少1枚為優(yōu)質(zhì)胚胎。優(yōu)質(zhì)胚胎根據(jù)人類體外受精-胚胎移植實(shí)驗(yàn)室操作專家共識(shí)中[7]定義為I級(jí)、II級(jí)胚胎。

2.對(duì)照組用藥：移植后常規(guī)黃體支持，陰道用黃體酮陰道緩釋凝膠(雪諾同，默克雪蘭諾，英國(guó))90 mg，每天一次；芬嗎通(雅培，荷蘭)黃片(2 mg/片)1片，口服，每日2次。

3.治療組用藥：移植日開始給予G-CSF注射液(吉賽欣，華北制藥漢坦生物技術(shù))150 μg，皮下注射，隔日一次，共注射5次，并隨訪觀察用藥期間有無不良反應(yīng)。其余用藥同對(duì)照組常規(guī)黃體支持。

4.妊娠結(jié)局判斷：移植14 d測(cè)血β-HCG>5 U/L為HCG陽性；HCG陽性但經(jīng)陰道B超于宮內(nèi)及宮外均未探及明顯孕囊或期間月經(jīng)來潮，復(fù)查HCG值下降或轉(zhuǎn)陰診斷為生化妊娠；陰道超聲探及孕囊，或者流產(chǎn)組織病理檢查提示為絨毛組織者診斷為臨床妊娠。臨床妊娠者記錄孕囊個(gè)數(shù)和妊娠結(jié)局。

三、觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn)

兩組患者一般資料(年齡、不孕年限、不孕類型、既往助孕周期數(shù)、BMI、基礎(chǔ)激素水平)；促排卵情況(Gn天數(shù)、Gn用量、獲卵數(shù)、MⅡ卵數(shù))；胚胎培養(yǎng)情況(受精率、正常受精率、可利用胚胎數(shù)、優(yōu)胚數(shù))；胚胎移植情況及妊娠結(jié)局(子宮內(nèi)膜厚度/分型/血流、移植胚胎數(shù)、移植優(yōu)胚數(shù)、HCG陽性率、臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率、胚胎種植率)。

胚胎種植率=總孕囊數(shù)/移植總胚胎數(shù)；HCG陽性率=HCG陽性例數(shù)/總移植周期數(shù)；臨床妊娠率=臨床妊娠例數(shù)/總移植周期數(shù)；流產(chǎn)率=流產(chǎn)人數(shù)/臨床妊娠人數(shù)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、患者一般情況比較

隨機(jī)入組患者每組各50例，因內(nèi)膜因素、胚胎因素、患者意愿等原因取消移植17例，最終將治療組41例、對(duì)照組42例相關(guān)數(shù)據(jù)納入統(tǒng)計(jì)分析。兩組患者間年齡、不孕年限、基礎(chǔ)激素水平等一般情況比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者一般情況比較[(-±s)，n(%)]

二、患者IVF-ET情況比較

1.促排卵、受精及胚胎培養(yǎng)情況比較：兩組患者間Gn天數(shù)/用量、獲卵數(shù)等比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；兩組間正常受精率、可利用胚胎數(shù)及優(yōu)胚數(shù)比較亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

2.移植前子宮內(nèi)膜情況比較：兩組患者間移植前子宮內(nèi)膜厚度、分型、血流比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

表2 兩組患者促排卵、受精及胚胎培養(yǎng)情況比較[(-±s)，%]

表3 兩組患者移植前子宮內(nèi)膜情況比較[(-±s)，n(%)]

3.胚胎移植及妊娠結(jié)局比較：兩組患者間移植胚胎數(shù)目、移植優(yōu)胚數(shù)等比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；G-CSF治療組HCG陽性率、臨床妊娠率、胚胎種植率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但兩組間早期流產(chǎn)率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表4)。

三、兩組患者胚胎移植14 d時(shí)β-HCG水平比較

兩組患者移植14 d時(shí)β-HCG水平比較，兩組HCG陽性者β-HCG水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，臨床妊娠者亦然(P>0.05)。考慮到單胎與雙胎分泌β-HCG差異，兩組單胎妊娠者β-HCG水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，雙胎妊娠者亦然(P>0.05)(表5)。

表4 兩組患者胚胎移植及妊娠結(jié)局比較[(-±s)，%]

表5 兩組患者胚胎移植14 d時(shí)不同妊娠結(jié)局者β-HCG水平比較(-±s)

四、不良反應(yīng)

治療組中發(fā)現(xiàn)15例使用G-CSF后白細(xì)胞輕度升高(后復(fù)查正常)、1例失眠，未發(fā)現(xiàn)其他不良反應(yīng)(如發(fā)熱、頭痛、皮膚異常和肝腎功異常等)以及嚴(yán)重不良反應(yīng)。

討 論

輔助生殖技術(shù)(ART)在不孕癥患者中的運(yùn)用日趨完善，控制性促排卵的方法也在摸索中前進(jìn)。促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRH-a)長(zhǎng)方案是經(jīng)典的鮮胚移植的促排卵方案，妊娠率穩(wěn)定，但是存在周期時(shí)間長(zhǎng)、容易發(fā)生卵巢過度刺激綜合征(OHSS)等缺點(diǎn)，于是GnRH拮抗劑方案在臨床實(shí)踐中應(yīng)運(yùn)而生，并以其周期治療時(shí)間短、更加符合生理過程的優(yōu)勢(shì)在控制性促排卵中占有越來越重要的地位。Grow等[8]回顧性分析ART中卵巢正常反應(yīng)患者，發(fā)現(xiàn)拮抗劑方案與長(zhǎng)方案患者相比，子宮內(nèi)膜容受性較差、種植率和活產(chǎn)率較低。陳崢屹等[9]認(rèn)為拮抗劑具有溶黃體作用，導(dǎo)致拮抗劑方案中存在黃體功能不足的情況，影響妊娠結(jié)局。其他研究也發(fā)現(xiàn)拮抗劑方案胚胎著床率低于GnRH-a長(zhǎng)方案，并認(rèn)為拮抗劑可能影響子宮內(nèi)膜容受性而使胚胎著床率降低[2-3]。李宣等[1]等認(rèn)為過低的LH水平可能與拮抗劑對(duì)內(nèi)源性LH的過度抑制有關(guān)，從而通過影響子宮內(nèi)膜容受性等環(huán)節(jié)，進(jìn)一步影響臨床妊娠結(jié)局，而合理控制HCG日LH水平可能有利于拮抗劑方案鮮胚移植臨床結(jié)局。由此可見拮抗劑方案鮮胚移植妊娠率下降備受臨床醫(yī)生的關(guān)注。

對(duì)于如何改善拮抗劑方案的妊娠結(jié)局，生殖醫(yī)生也進(jìn)行了大量研究工作。Copperman等[10]認(rèn)為反向添加重組人LH(rLH)可對(duì)抗大劑量拮抗劑引起的LH耗竭，從而提高妊娠率。徐蓓等[11]研究表明拮抗劑方案不宜延遲扳機(jī)，尤其對(duì)于如Gn使用時(shí)間較長(zhǎng)或孕酮水平高于1 ng/ml(3.17 nmol/L)時(shí)，以防扳機(jī)時(shí)機(jī)后延致內(nèi)膜發(fā)育不同步，從而影響妊娠結(jié)局。對(duì)于拮抗劑方案鮮胚移植患者，是否需要加強(qiáng)黃體支持及如何進(jìn)行黃體支持尚無定論，常用方法為加強(qiáng)補(bǔ)充雌/孕激素和雙扳機(jī)或取卵日添加HCG，而GnRH-a作為新型的黃體支持藥物仍存在爭(zhēng)議。如何提高拮抗劑方案鮮胚移植的妊娠率有待進(jìn)一步研究。

目前生殖免疫學(xué)是生殖領(lǐng)域新的交叉學(xué)科與研究熱點(diǎn)。G-CSF于1983年首次在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，其為一種分子量約為2萬的糖蛋白，屬于骨髓造血細(xì)胞的增殖因子，可以廣泛作用于骨髓微環(huán)境，其受體在多種髓系細(xì)胞表面均有表達(dá)，還可見于內(nèi)皮細(xì)胞、胎盤細(xì)胞、滋養(yǎng)細(xì)胞、胎母細(xì)胞界面和顆粒黃體化細(xì)胞等[12-14]。胚胎種植是個(gè)復(fù)雜的過程，免疫細(xì)胞在子宮內(nèi)膜容受性中發(fā)揮著重要作用，成功植入及妊娠需要免疫平衡[15]。學(xué)者認(rèn)為G-CSF在窗口植入期可抑制機(jī)體對(duì)胚胎發(fā)動(dòng)的免疫攻擊，使子宮內(nèi)膜具有足夠的容受性幫助胚胎著床[16]。G-CSF還可以通過增加白細(xì)胞介素-10(IL-10)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β等趨化因子的分泌，誘導(dǎo)Th-2免疫應(yīng)答，參與胚胎著床期間子宮內(nèi)膜的成熟[17]。徐士儒等[18]發(fā)現(xiàn)拮抗劑方案可顯著上調(diào)子宮內(nèi)膜各免疫細(xì)胞的陽性細(xì)胞率，提示免疫細(xì)胞可能影響子宮內(nèi)膜容受性。

臨床研究方面，Aleyasin等[6]在一項(xiàng)多中心隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)中評(píng)價(jià)全身單劑量皮下G-CSF給藥對(duì)不孕女性IVF-ET成功率的影響，干預(yù)組在胚胎移植前1 h皮下注射G-CSF 300 μg，發(fā)現(xiàn)該方法顯著增加反復(fù)種植失敗(RIF)患者的妊娠率。Zhang等[19]的Meta分析發(fā)現(xiàn)G-CSF通過局部宮腔灌注與皮下注射兩種途徑對(duì)胚胎移植的臨床結(jié)局有著積極的影響。既往眾多研究通過宮腔灌注G-CSF改善子宮內(nèi)膜容受性，治療薄型子宮內(nèi)膜，提高胚胎植入率與臨床妊娠率[20-21]。由此可見，通過局部宮腔灌注與皮下注射兩種方法均可對(duì)胚胎移植的妊娠結(jié)局產(chǎn)生影響，鑒于鮮胚移植周期不適宜宮腔灌注的方法，本中心采用移植后皮下注射G-CSF，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)G-CSF治療組HCG陽性率、臨床妊娠率及胚胎種植率顯著優(yōu)于對(duì)照組，與既往研究結(jié)果相一致。我們進(jìn)一步將對(duì)照組與治療組妊娠后不同妊娠狀態(tài)下的血清β-HCG水平進(jìn)行比較，探索G-CSF是否可通過生化學(xué)指標(biāo)來反應(yīng)滋養(yǎng)細(xì)胞的功能變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組間HCG陽性者、臨床妊娠者、單胎妊娠者、雙胎妊娠者的移植后14 d血清β-HCG水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。需要進(jìn)一步尋找其它指標(biāo)來驗(yàn)證G-CSF改善妊娠結(jié)局的途徑。

G-CSF在IVF-ET拮抗劑方案鮮胚移植過程中使用，可以改善妊娠結(jié)局。該方法可為臨床提高拮抗劑方案鮮胚移植妊娠率提供新思路，但其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。G-CSF對(duì)子宮內(nèi)膜蛻膜化的調(diào)節(jié)可能是通過G-CSF數(shù)量的改變來控制不同類型的分泌細(xì)胞數(shù)量，從而使內(nèi)膜分泌的各種生物活性因子達(dá)到更利于胚胎植入的狀態(tài)[22]，進(jìn)而達(dá)到改善妊娠結(jié)局的作用。但本研究缺乏相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定來驗(yàn)證猜想，后期的研究設(shè)計(jì)應(yīng)同時(shí)測(cè)定血清細(xì)胞因子，以進(jìn)一步確定其作用機(jī)制。此外本研究樣本量偏少，將來應(yīng)設(shè)計(jì)大樣本或多中心的臨床研究來避免因樣本量造成的結(jié)果偏倚。