圖1 郁金的薄層色譜鑒定圖（紫外光）

圖2 姜黃的薄層色譜鑒定圖（日光及紫外光）

圖3 對照品

圖4 陰性對照

圖5 樣品

應激寧是按中醫(yī)藥理血、平肝、補益、祛濕原理，篩選出以郁金、姜黃及刺五加三味中藥組成的復方中藥制劑，其中郁金作為理血藥，起行氣化瘀、疏肝利膽等作用；姜黃作為平肝藥，主治氣滯血瘀，以活血為主，兼可行氣；刺五加作為補益、祛濕藥，具有益氣健脾，補腎安神的功能。現(xiàn)代研究表明，郁金具有保護肝細胞、增加肝酶活性、促進肝細胞再生、抗氧化、改善血液流變性等作用；姜黃主要成分為姜黃酮、姜黃素，具有改善肝膽實質(zhì)細胞病損、利膽促代謝、抗炎、抗氧化等多種功效；刺五加具有抗應激、改善內(nèi)分泌和對病理過程起調(diào)節(jié)作用，三味藥合用共同發(fā)揮其疏肝利膽，抗應激之功效，從而增強魚體抗病力。為有效控制該制劑的質(zhì)量，對其進行定性鑒別和定量分析研究，結(jié)果顯示，制劑中郁金和姜黃薄層鑒別特征明顯，陰性無干擾；采用高效液相色譜法測定制劑中姜黃素含量簡便準確，重復性好。

1 儀器與試藥

島津LC-10AT型高效液相色譜儀，十萬分之一天平（METTLER TOLEDO XS205）。色譜柱：十八烷基鍵合硅膠柱（ExformmaC18 色譜柱，4.6×250mm，5μm）。應激寧（武漢華揚藥業(yè)有限責任公司），姜黃素標準品：LOT：110823-201004，中國藥品生物制品檢定所。甲醇（國藥試劑）色譜純，乙腈（國藥試劑）色譜純，冰乙酸（國藥試劑）色譜純。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 郁金薄層鑒別

取應激寧樣品3批及陰性對照5g，加無水乙醇25mL，超聲處理30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇1mL使溶解，作為供試品溶液。另取郁金對照藥材2g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各5μL，分別于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（17∶3）為展開劑，預飽和30min，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。置日光和紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的主斑點和熒光斑點。

2.1.2 姜黃薄層鑒別

取應激寧樣品3批及陰性對照0.6g，加無水乙醇20mL，超聲處理30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇2mL使溶解，作為供試品溶液。另取姜黃對照藥材0.2g，同法制成對照藥材溶液。再取姜黃素對照品，加無水乙醇制成每1mL含0.5mg，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述三種溶液各4μL，分別于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（96∶4∶0.7）為展開劑，展開，取出，晾干，分別置日光下和紫外燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，分別顯相同顏色的斑點和熒光斑點。

2.2 姜黃素含量測定

2.2.1 溶液的制備

標準儲備液制備：精密稱取姜黃素對照品10.12mg（對照品含量為98.8%），置100ml量瓶中，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，得標準品儲備液（100μg/mL）。

樣品溶液制備：取本品細粉約0.6g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，稱定重量，加熱回流30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾。精密量取1mL濾液，置于10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

陰性對照溶液的制備：根據(jù)樣品處方，制備不含姜黃藥材的陰性樣品，按樣品溶液制備方法進行樣品處理。

2.2.2 色譜條件

色譜柱：十八烷基鍵合硅膠柱（ExformmaC18 色譜柱，4.6×250mm，5μm），流動相：乙腈-4%冰醋酸溶液（48∶52），流速：1.0 mL/min，檢測波長：430nm，柱溫：35℃，進樣量：20μL。

2.2.3 系統(tǒng)適用性

取上述對照樣品、樣品溶液、陰性對照溶液各20μl，注入液相色譜儀，按照上述色譜條件測定，結(jié)果見圖3～圖5。姜黃素的保留時間為16min，圖譜表明陰性對照液色譜無干擾，理論塔板數(shù)（以姜黃素計算）不低于8,000。

2.2.4 線性關系考察

精密稱取姜黃素對照品10.12 mg（對照品含量為98.8%），置100mL量瓶中，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，得標準品儲備液（100μg/mL）。

精密吸取上述溶液0.25、0.5、1、2、4、5mL置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得濃度依次2.5、5、10、20、40、50μg/mL的標準品溶液。各取20μl進樣，記錄色譜圖，由峰面積A對溶液濃度C進行線性回歸，y= 99907x+51179，R2=0.999，在2.5～50μg/mL濃度間，標準曲線的R2=0.999，本法的線性關系良好。

2.2.5 精密度試驗

取5、10、20μg/mL三個濃度的樣品在1d內(nèi)分別重復進樣5次，在第1、3、5d內(nèi)分別每天1次重復進樣，測定日內(nèi)及日間RSD，結(jié)果見表1和表2。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗

取20180125批號金黃疏肝應激散樣品，按供試品項下方法處理后，分別避光放置0，4，8，12和24h后進行測定，考察溶液的穩(wěn)定性，不同時間點主峰出峰時間一致，峰面積近似相等，樣品在48h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 最低檢測限

以信噪比為2∶1時相應濃度確定檢測限。姜黃素的最低檢測限為0.01μg/mL。

2.2.8 回收率試驗

精密稱取姜黃素2mg、2.5mg和3mg分別置于三個具塞錐形瓶中，分別加入處方量的郁金和刺五加，精密加入甲醇25mL，稱定重量，加熱回流30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾。精密量取1mL濾液，置于10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。按上述測定法測定，計算回收率，結(jié)果見表4。表明，高、中、低三種濃度的回收率在94.31%以上，符合規(guī)定。

2.2.9 含量測定

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以C18硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-4%冰醋酸溶液（48∶52）為流動相，流速為1.0 mL/min，檢測波長為430nm。理論塔板數(shù)按姜黃素峰計算不低于4,000。

對照品溶液的制備：精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥恒重的姜黃素對照品10mg，置100mL量瓶中，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，得標準品儲備液（100μg/mL）。精密吸取上述溶液1mL置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得濃度10μg/mL的標準品溶液，取20μL進樣。

表1 姜黃素日內(nèi)變異系數(shù)（n=5）

表2 姜黃素日間變異系數(shù)

表3 溶液穩(wěn)定性考察結(jié)果

表4 姜黃素回收率試驗結(jié)果（n=3）

表5 三批中試樣品姜黃素含量測定結(jié)果

供試品溶液的制備：精密稱取三批中試（批號：20180125、20180126、20180127）金黃疏肝應激散樣品各0.6g，平行操作2份。置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，稱定重量，加熱回流30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾。精密量取1mL濾液，置于10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。按外標法以峰面積計算樣品中姜黃素的含量。結(jié)果見下表5。

3 小結(jié)

應激寧是我公司研發(fā)的純中藥制劑，用于防治草魚肝膽綜合征，增強機體抗應激能力和抗病力，預防和緩解由應激引起的體表出血癥，減少疾病的發(fā)生。為了提高產(chǎn)品質(zhì)量的可控性，我們對產(chǎn)品進行了系統(tǒng)質(zhì)量標準研究，建立了本產(chǎn)品質(zhì)量標準。