王新靜 趙昕 張欣雪 曹迪 任章勇 賈利猛 郎韌 賀強(qiáng)

1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院肝膽胰脾外科，北京 100020；2北京市海淀醫(yī)院普通外科，北京 100080

胰腺癌相關(guān)糖尿病(pancreatic cancer-associated diabetes mellitus, PCDM)指胰腺癌(pancreatic cancer, PC)確診前2年內(nèi)診斷的糖尿病[1]。研究發(fā)現(xiàn)，PC患者有68%會(huì)新發(fā)糖尿病，明顯高于肺癌、乳腺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌[2]。74%～88%伴有糖尿病的PC患者其糖尿病發(fā)生于PC確診之前的2～5年[1,3-4]。由于PCDM與PC的診斷有一定的時(shí)間關(guān)系，因此如果能夠發(fā)現(xiàn)PCDM始動(dòng)基因，將有利于PC的早期診斷。本研究基于癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)-PC數(shù)據(jù)集mRNA的表達(dá)數(shù)據(jù)，通過(guò)生物信息學(xué)方法分析PCDM的基因特征，探索PCDM潛在的分子標(biāo)志物。

資料與方法

一、一般資料與分組

通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gdac.broadinstitute.org)下載PC臨床數(shù)據(jù)和相應(yīng)的基因組mRNA芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)。臨床病理數(shù)據(jù)包括185例PC患者的信息，主要有性別、年齡、腫瘤分期、放療、藥物治療、伴隨疾病、復(fù)發(fā)和預(yù)后情況等；基因組mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)包含其中183例PC腫瘤樣本的20 531個(gè)基因的芯片表達(dá)數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)Quantile標(biāo)準(zhǔn)化及l(fā)og2處理。將既往無(wú)糖尿病的PC患者歸為PC組(109例)，PC確診前2年內(nèi)新發(fā)糖尿病的患者歸為PCDM組(11例)，排除63例糖尿病病史超過(guò)2年的PC患者。

二、基因表達(dá)差異分析

采用R軟件“l(fā)imma”程序包[5]，比較PCDM組與PC組基因表達(dá)量的差異，以|log2fold change|>2且P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，篩選差異表達(dá)基因(differentially expressed genes, DEGs)并繪制“火山圖”。

三、DEGs的功能富集分析

使用R軟件“clusterProfiler”程序包對(duì)DEGs進(jìn)行功能富集分析，包括基因本體(gene ontology, GO)分析和京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路富集分析[6]。其中GO分析包括生物學(xué)過(guò)程、分子功能、細(xì)胞組分分析。

四、構(gòu)建蛋白相互作用(protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)

通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)分析PCDM的DEGs相互作用的關(guān)系，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并通過(guò)Cytoscape軟件(3.7.2版本)將結(jié)果可視化，最后通過(guò)MCODE模塊篩選樞紐基因。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用R軟件(3.5.2版本)整理數(shù)據(jù)，通過(guò)貝葉斯檢驗(yàn)比較PCDM組與PC組的基因表達(dá)量。連續(xù)性變量的組間比較采用方差分析，分類變量比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、PCDM組與PC組的臨床病理特征

PCDM組和PC組患者的一般資料及臨床病理特征的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 胰腺癌相關(guān)糖尿病組與胰腺癌組的臨床病理特征比較

二、PCDM的DEGs

與PC組比較,PCDM組有107個(gè)DEGs(|log2fold change|>2且P<0.05)，其中47個(gè)基因明顯上調(diào)，60個(gè)基因明顯下調(diào)(圖1，表2)。

圖1 胰腺癌相關(guān)糖尿病差異表達(dá)基因的火山圖

表2 胰腺癌相關(guān)糖尿病差異表達(dá)基因

三、PCDM 107個(gè)DEGs的功能富集分析

對(duì)107個(gè)PCDM DEGs的GO功能分析發(fā)現(xiàn)，在生物學(xué)功能方面，基因的主要功能為正向調(diào)節(jié)細(xì)胞分泌和維持細(xì)胞鈣離子的穩(wěn)態(tài)(圖2A)；在細(xì)胞組分方面，基因的主要功能與小泡腔、細(xì)胞質(zhì)微管腔和細(xì)胞外基質(zhì)成分相關(guān)(圖2B)；在分子功能方面，基因主要參與受體活性調(diào)節(jié)及碳水化合物的結(jié)合(圖2C)。KEGG通路富集分析顯示，107個(gè)DEGs主要參與細(xì)胞因子、受體間相互作用，病毒蛋白與細(xì)胞因子受體的相互作用及趨化因子信號(hào)等通路(圖2D)。

圖2 胰腺癌相關(guān)糖尿病差異基因功能及通路富集分析

四、PCDM 107個(gè)DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)分析及樞紐基因

通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，基于107個(gè)PCDM的DEGs構(gòu)建了PPI網(wǎng)絡(luò)；通過(guò)MCODE模塊識(shí)別了5個(gè)樞紐基因，分別為GNG8、CNR2、GALR2、CXCL13、NPY2R(圖3)。

圖3 胰腺癌相關(guān)糖尿病特征基因蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

討 論

胰腺癌是惡性程度極高的消化道腫瘤，5年生存率僅8%[7]。發(fā)病隱匿、缺少特異性標(biāo)志物、易早期轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胰腺癌預(yù)后不良的主要原因，因此探索胰腺癌早期始動(dòng)基因和相關(guān)機(jī)制對(duì)于早期診斷、提高生存率有重要意義。糖尿病與胰腺癌相互影響、互為因果、關(guān)系密切[8]。研究顯示糖尿病是胰腺癌的危險(xiǎn)因素。Lu等[9]對(duì)新發(fā)2型糖尿病患者隨訪發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者罹患胰腺癌風(fēng)險(xiǎn)高于非糖尿病患者；在糖尿病診斷5年內(nèi)隨訪，第1年的胰腺癌發(fā)病率最高。同健康人群相比，新發(fā)糖尿病患者罹患胰腺癌的概率提高了8倍，特別是PCDM的患者大部分是在胰腺癌診斷數(shù)年前被診斷糖尿病[8]。因此推測(cè)新發(fā)糖尿病可能是胰腺癌早期臨床表現(xiàn)之一[10]。

鑒別新發(fā)糖尿病尤其是PCDM，對(duì)于胰腺癌的早期診治具有重要的臨床意義[11]。對(duì)新發(fā)糖尿病患者進(jìn)行PCDM的篩查是診斷無(wú)癥狀胰腺癌和提高胰腺癌患者生存率的重要手段之一[12]。Illes等[13]定期隨診115例新發(fā)2型糖尿病患者，進(jìn)行CA19-9檢測(cè)和超聲檢查，必要時(shí)CT檢查，結(jié)果顯示其中10例CA19-9升高，但未發(fā)現(xiàn)胰腺癌，而3例CA19-9正常的隨訪者被確診為胰腺癌，可見(jiàn)CA19-9不宜作為PCDM的分子標(biāo)志物。PCDM可能與腫瘤所致胰島素抵抗、癌組織釋放過(guò)多的細(xì)胞因子和胰島淀粉多肽、自身免疫紊亂、腫瘤細(xì)胞破壞胰島等因素有關(guān)[14]。因此通過(guò)探索PCDM的特征性基因，以此為出發(fā)點(diǎn)尋找潛在的分子標(biāo)志物可能為胰腺癌的早期診斷提供新的思路。

近年來(lái)，TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)不僅提供了人體常見(jiàn)腫瘤的基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組等多組學(xué)數(shù)據(jù)，還公布了臨床病理數(shù)據(jù)及長(zhǎng)期隨訪數(shù)據(jù)，是研究基因與腫瘤表型關(guān)系的寶貴資源?；诖?，本研究借助TCGA-PC數(shù)據(jù)集，將患者分為PCDM組和PC組，結(jié)果顯示兩組在臨床病理特征方面無(wú)明顯差異，在107個(gè)DEGs中，GNG8、CNR2、GALR2、CXCL13、NPY2R可能是PCDM的特征性基因。

CNR2是大麻素CB2受體基因，與胰島素分泌相關(guān)。研究顯示，CB2受體在胰島β細(xì)胞表達(dá)；在人胰島細(xì)胞灌注實(shí)驗(yàn)中，CB2受體激動(dòng)劑可通過(guò)開(kāi)放鈣離子通道，促進(jìn)β細(xì)胞分泌胰島素[15]。此外CNR2的激活還可以通過(guò)EGF/EGFR和IGF-I/IGF-IR通路抑制乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移[16]。本研究結(jié)果顯示PCDM組CNR2表達(dá)明顯下調(diào)，可能與胰島素分泌不足及抑癌作用受損有關(guān)。

GALR2為2型Galanin受體，是一種抗糖尿病和抗炎神經(jīng)肽。文獻(xiàn)提示中樞神經(jīng)系統(tǒng)中GALR2可以促進(jìn)糖代謝，其高表達(dá)可以抑制胰島素抵抗，避免血糖升高[17]。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示激活GALR2可減輕肥胖小鼠骨骼肌的胰島素抵抗[18]。本研究結(jié)果顯示，PCDM組GALR2作為樞紐基因表達(dá)明顯下調(diào)，提示該基因表達(dá)下調(diào)有可能引起胰腺癌相關(guān)糖尿病的發(fā)生。此外，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在裸鼠-人頭頸癌細(xì)胞皮下成瘤模型中，GALR2通過(guò)p38-MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)促血管生成細(xì)胞因子、VEGF和IL-6的分泌，誘導(dǎo)血管生成，導(dǎo)致頭頸部鱗狀細(xì)胞癌侵襲性生長(zhǎng)[19]；在涎腺導(dǎo)管癌，GALR2處于高甲基化狀態(tài)，與預(yù)后不良相關(guān)[20]；Galanin蛋白作為一種腫瘤抑制蛋白，在胃癌發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用[21]。但GALR2在胰腺癌的作用尚無(wú)報(bào)道，具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

CXCLl3在人體肝臟、血清和淋巴結(jié)均有表達(dá)，具有吸附B細(xì)胞的能力，被稱為B細(xì)胞吸附因子。在正常小鼠胰島中CXCL13過(guò)表達(dá)，可通過(guò)吸附淋巴細(xì)胞，形成異位淋巴結(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，外周淋巴組織如脾、淋巴結(jié)功能的維持均需要CXCLl3的參與。此外胰島β細(xì)胞的形成也依賴于CXCLl3的正常表達(dá)，如在非肥胖型糖尿病小鼠注射CXCLl3趨化因子，可阻斷糖尿病進(jìn)展[22]。鱗狀細(xì)胞癌和乳腺癌組織中CXCL13作為一種趨化因子具有招募免疫細(xì)胞、抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用[23-24]。本研究顯示PCDM組CXCL13明顯下調(diào)，提示CXCL13可能參與胰腺癌新發(fā)糖尿病的發(fā)生，并在胰腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮一定的作用。

NPY2R為男性糖尿病患者的神經(jīng)肽Y受體2[25]，其高表達(dá)與糖尿病及其并發(fā)癥的進(jìn)展相關(guān)，如在1型糖尿病患者隊(duì)列研究中，NPY2R可能與嚴(yán)重糖尿病導(dǎo)致的視網(wǎng)膜病變有關(guān)[26]。也有研究顯示，NPY2R在伴有糖尿病的心臟病患者的右心房肌肉組織中表達(dá)明顯降低,可能與器官特異性有關(guān)[27]。此外，NPY2R還參與了某些腫瘤的發(fā)生過(guò)程[28]，如在口腔癌患者中，NPY2R啟動(dòng)子甲基化更容易引起腫瘤復(fù)發(fā)[29]；在復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者中，NPY2R的TT基因型頻率明顯增高[30]?？梢?jiàn)，NPY2R與糖尿病及腫瘤均相關(guān)，但在胰腺癌的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究由于受TCGA-PC數(shù)據(jù)集中病例樣本的限制，無(wú)法將正常胰腺與糖尿病患者的胰腺組織進(jìn)行對(duì)比，影響了結(jié)果的特異性。PCDM組樣本偏少也影響了結(jié)果的可信度，因此擴(kuò)大樣本量，收集適宜的胰腺組織樣本，再進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析有可能揭示PCDM的始動(dòng)因素，進(jìn)而為胰腺癌的早期診斷篩選可靠的新型分子標(biāo)志物。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突