李麗梅，劉霞，李喜宏，楊鴻遠(yuǎn)，趙亞婷

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457；2.長(zhǎng)融匯通（天津）食品科技研發(fā)有限公司，天津 300457）

霉菌侵染是引起生鮮葡萄采后霉變腐爛的主要原因。我國(guó)每年因此而導(dǎo)致的葡萄等大宗果蔬損失占其總產(chǎn)量的30%～40%左右[1]，尤其在常溫、亞常溫的運(yùn)輸和銷售過(guò)程中，擠壓及機(jī)械傷口極易引起黑曲霉（Aspergillus niger）的大范圍的感染，即黑粉病，導(dǎo)致果蔬失去其食用價(jià)值和商品價(jià)值。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究更多地利用生物防治的方法來(lái)對(duì)葡萄等大宗果蔬進(jìn)行保鮮，致力于篩選非致病微生物抑制某些致病致腐霉菌的生長(zhǎng)和繁殖。范青等[2]研究發(fā)現(xiàn)季也蒙假絲酵母能夠抑制成熟的桃果實(shí)的軟腐病，成熟的桃果實(shí)用酵母菌細(xì)胞懸浮液處理后，在25℃條件下儲(chǔ)藏4 d，其軟腐病的發(fā)病率為零。Lucia Parafati等[3]研究證明釀酒酵母對(duì)葡萄采后灰霉病具有較好的防治作用。秦丹[4]篩選到一株季也蒙畢赤氏酵母對(duì)葡萄果實(shí)采后灰霉葡萄孢病害具有拮抗作用，并研制出拮抗酵母的生防制劑。

本試驗(yàn)以紅提葡萄為試材，以黑曲霉為模式菌株，模擬常溫銷售過(guò)程中不同方式的機(jī)械傷及黑曲霉侵染方式對(duì)葡萄造成的病害程度，通過(guò)離體和活體雙重試驗(yàn)，研究不同拮抗菌對(duì)黑曲霉采后病害及生物防治的效果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紅提葡萄：天津市經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)金元寶批發(fā)市場(chǎng)；拮抗菌株：天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院321實(shí)驗(yàn)室自行分離于葡萄等果蔬表面，并保藏于-80℃條件下；黑曲霉：天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院321實(shí)驗(yàn)室自行分離于葡萄表面，并保藏于-80℃條件下。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖（potato dextrost agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌20 min。

營(yíng)養(yǎng)酵母葡萄糖肉湯（nutrient yeast dextrost broth，NYDB）培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)肉湯8 g，酵母浸膏5 g，葡萄糖10 g，蒸餾水 1 000 mL，121℃滅菌 20 min。

1.3 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

LB-BC58F高壓蒸汽滅菌鍋：上海三申醫(yī)療器械有限公司；CBV-1500A無(wú)菌實(shí)驗(yàn)臺(tái)：上海瑞仰凈化裝備有限公司；5804（R）冷凍離心機(jī)：德國(guó) Eppendorf公司；JJ-1000精密型電子天平：常熟雙杰測(cè)試儀器廠；BMJ-250C霉菌培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 黑曲霉的致病曲線研究

設(shè)置1 mm～2 mm、2 mm～3 mm、3 mm～4 mm 3個(gè)傷口刺破直徑，104、105、106spores/mL 3 個(gè)致病菌濃度，采用活體接種致病菌的方式模擬常溫銷售過(guò)程中的可能機(jī)械傷害[5]，通過(guò)定期測(cè)定病斑直徑確定最適的活體試驗(yàn)接種參數(shù)。

1.4.2 拮抗菌對(duì)黑曲霉的生防效果研究

拮抗菌菌懸液的制備[6]：將分離的酵母菌接種于盛有40 mL營(yíng)養(yǎng)酵母葡萄糖肉湯（NYDB）液體培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，于28℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)36 h～48 h，5 000 r/min離心10 min，收集酵母菌體細(xì)胞，用0.9%的無(wú)菌生理鹽水重新懸浮，血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，用分光光度計(jì)配成濃度1.0×108CFU/mL～1.2×108CFU/mL的菌體懸浮液備用。

病原菌孢子的制備：病原菌于28℃下PDA平板培養(yǎng)4 d～6 d至孢子大量產(chǎn)生后，用0.9%無(wú)菌生理鹽水洗下病原菌孢子，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)孢子濃度為 1×104spores/mL～1.2×104spores/mL，備用。

1.4.3 拮抗菌的生防效果離體試驗(yàn)

采用濾紙片法測(cè)定拮抗菌對(duì)優(yōu)勢(shì)致病菌的離體拮抗效果。用移液槍吸取100 μL病原菌孢子懸浮液于平板上，并用涂布棒涂布均勻。在培養(yǎng)基上放置直徑為5.0 mm的濾紙片，用移液槍吸取10 μL的拮抗菌菌懸液于濾紙片上，每個(gè)平板放2個(gè)濾紙片，于28℃培養(yǎng)3 d～4 d后，采用十字交叉法用游標(biāo)卡尺測(cè)量濾紙片周圍抑菌圈直徑[7]。

1.4.4 拮抗菌的生防效果活體試驗(yàn)

葡萄果實(shí)的處理[8]：挑選大小、成熟度一致的果粒，用剪刀將葡萄果粒從葉莖上剪下，防止葡萄果粒干枯，每個(gè)葡萄果粒上留有5 mm的果梗[9]。將葡萄果粒浸入無(wú)菌的2%次氯酸鈉溶液中2 min，然后用無(wú)菌水沖洗，在無(wú)菌操作臺(tái)中晾干。

活體篩選：待葡萄果粒表面無(wú)水分殘留時(shí)，用無(wú)菌牙簽刺破果實(shí)胴部人為造成傷口[10]，傷口直徑3 mm～4 mm，深5 mm，每一傷口加入10 μL酵母菌培養(yǎng)液（108cfu/mL），2 h后，加入10 μL病原菌孢子懸浮液（104spores/mL），室溫（25℃）下放置 1 h，待果實(shí)風(fēng)干至傷口邊緣無(wú)流動(dòng)菌液后置于無(wú)菌培養(yǎng)皿蓋中，用保鮮膜進(jìn)行密封，以30℃/93%濕度恒溫保濕培養(yǎng)，5 d～7 d后測(cè)量傷口病斑大小和腐爛率，對(duì)照組加入無(wú)菌水和對(duì)應(yīng)的病原菌孢子懸浮液，每個(gè)處理6個(gè)平行。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)利用Excel 2016軟件進(jìn)行計(jì)算平均值和偏差，Origin pro 8.0進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同刺傷直徑對(duì)黑曲霉發(fā)病的影響

不同接種濃度對(duì)刺破傷口1 mm～2 mm時(shí)病斑直徑的影響見圖1。

圖1 不同接種濃度對(duì)刺破傷口1 mm～2 mm病斑直徑的影響Fig.1 Effects of different inoculation concentrations on lesion diameter of wound 1 mm-2 mm

葡萄常溫物流過(guò)程中尤其在果梗基部或是受機(jī)械傷害后極易受到黑曲霉快速接觸侵染[11]，引起黑粉病，導(dǎo)致葡萄組織非水漬狀腐爛、褐變。由圖1可知，傷口刺破直徑為1 mm～2 mm時(shí)，在接種2 d后，黑曲霉發(fā)病的病斑直徑變化較快，均呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系。隨著接種濃度的增大，病斑直徑也呈線性增加，接種病原孢子濃度為106spores/mL時(shí)，病斑直徑在第5天最大，平均值為13.99 mm，與接種病原孢子濃度為105spores/mL處理組的病斑直徑無(wú)顯著性差異。

不同接種濃度對(duì)刺破傷口2 mm～3 mm時(shí)病斑直徑的影響見圖2。

圖2 不同接種濃度對(duì)刺破傷口2 mm～3 mm病斑直徑的影響Fig.2 Effects of different inoculation concentrations on lesion diameter of wound 2 mm-3 mm

由圖2可知，傷口刺破直徑為2 mm～3 mm時(shí)，1 d就呈現(xiàn)明顯的發(fā)病癥狀，此后發(fā)病3個(gè)接種濃度的病斑直徑變化較一致，第5天時(shí)，病原孢子濃度106spores/mL時(shí)病斑直徑較其他兩組稍大，其平均病斑大小為16.85 mm。

不同接種濃度對(duì)刺破傷口3 mm～4 mm時(shí)病斑直徑的影響見圖3。

圖3 不同接種濃度對(duì)刺破傷口3 mm～4 mm病斑直徑的影響Fig.3 Effects of different inoculation concentrations on lesion diameter of wound 3 mm-4 mm

圖3結(jié)果表明，當(dāng)傷口直徑3 mm～4 mm時(shí)，在接種量相同，接種濃度為105spores/mL時(shí)，5 d后病斑直徑最大，可能的原因是傷口內(nèi)表面面積與病原菌孢子液接觸面有差異，傷口直徑較前兩個(gè)傷口直徑大，孢子液沒有完全覆蓋傷口，導(dǎo)致表面病斑直徑較小。比較圖1、圖2和圖3，病原孢子液濃度與傷口直徑均會(huì)影響到病斑直徑，接種濃度為105spores/mL、傷口直徑為3 mm～4 mm時(shí)，病斑變化最大并且在5 d后病斑直徑最大，病斑平均大小為20.30 mm。

2.2 拮抗菌的離體抑菌效果

在前期拮抗菌篩選中，拮抗酵母篩選方法參照李莉[10]的方法，得到了5株酵母，將其編號(hào)為YT-1、YT-2、YT-3、YT-4、YT-5。拮抗菌 YT－2 對(duì)黑曲霉的離體拮抗效果見圖4，5株拮抗菌對(duì)黑曲霉的離體拮抗效果見表1。

圖4 拮抗菌YT－2對(duì)黑曲霉的離體拮抗效果Fig.4 Antagonistic effect of antagonistic bacterium YT-2 on Aspergillus niger in vitro

表1 5株拮抗菌對(duì)黑曲霉的離體拮抗效果Table 1 Antagonistic effect of five antagonistic bacteria against Aspergillus niger in vitro

由表1的抑菌圈結(jié)果可知，5株酵母對(duì)黑曲霉均有不同程度的拮抗效果。對(duì)黑曲霉抑菌效果最好的是YT-2，其抑菌直徑為（15.76±1.79）mm，其次為 YT-3，抑菌圈直徑（15.42±2.87）mm。YT-4和YT-5抑菌效果相對(duì)較差，抑菌圈直徑僅為（11.23±1.14）mm和（11.23±3.21）mm。從圖4可以看出，YT-2拮抗菌的抑菌圈外緣并沒有明顯的無(wú)菌圈，由此可推測(cè)拮抗菌的抑菌機(jī)理可能為營(yíng)養(yǎng)與空間競(jìng)爭(zhēng)或其他，可能拮抗菌并沒有在體外分泌抗菌物質(zhì)[12]，拮抗酵母的抑菌效果可結(jié)合活體試驗(yàn)綜合評(píng)價(jià)拮抗菌的拮抗效果。

2.3 黑曲霉拮抗菌的活體抑菌效果

通過(guò)果實(shí)活體接種法，分別將前期分離到的5種拮抗菌與黑曲霉共同接種到果實(shí)傷口處。拮抗菌YT-2對(duì)黑曲霉的活體拮抗效果見圖5，5株拮抗菌對(duì)黑曲霉的活體拮抗效果見表2。

圖5 拮抗菌YT-2對(duì)黑曲霉的活體拮抗效果Fig.5 Antagonistic effect of antagonistic bacterium YT-2 on Aspergillus niger in vivo

從表2可以看出，拮抗菌培養(yǎng)后篩選到對(duì)黑曲霉有顯著抑菌效果的拮抗菌株YT-2，其次為YT-5，接種該菌株的葡萄果粒均沒有明顯黑粉病癥狀，但是病斑直徑分別為（3.20±0.46）mm 和（5.90±3.22）mm，顯著低于對(duì)照和其他菌株。從圖5中可以看出，接種YT-2菌株的試驗(yàn)組病斑直徑比初始傷口直徑略大，并且傷口表面比較干燥及周圍葡萄果粒組織均較好，無(wú)黏稠軟爛現(xiàn)象，呈現(xiàn)愈合現(xiàn)象。原因可能是接種拮抗酵母后，拮抗酵母迅速繁殖，同時(shí)與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)與生存空間，快速利用了傷口表面的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并占據(jù)生存空間，導(dǎo)致病原菌失去營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生存空間，無(wú)法生長(zhǎng)繁殖以及產(chǎn)生有毒物質(zhì)，從而在宏觀上抑制了病害的發(fā)生[13]。此外，可能是拮抗酵母在葡萄果實(shí)或者果實(shí)傷口的生長(zhǎng)與繁殖能夠誘導(dǎo)果實(shí)自身抗性酶增加或者抗性酶活性增強(qiáng)，從而發(fā)揮拮抗作用[14]，YT-2與YT-3在離體篩選中也表現(xiàn)較強(qiáng)的抑菌效果，活體條件下，YT-2對(duì)黑曲霉抑制率為100%。

表2 5株拮抗菌對(duì)黑曲霉的活體拮抗效果Table 2 Antagonistic effect of five antagonistic bacteria against Aspergillus niger in vivo

3 結(jié)論

通過(guò)離體和活體雙重試驗(yàn)，篩選出采后黑曲霉病害的最佳拮抗菌為YT-2。研究得出模擬刺破傷口3 mm～4 mm，病原菌接種量105spores/mL時(shí)，病斑傷害最大，拮抗酵母菌對(duì)黑曲霉抑制效果最佳，離體抑菌直徑為（15.76±1.79）mm，活體條件下對(duì)黑曲霉抑制率為100%。拮抗酵母YT-2常溫下能夠有效抑制黑曲霉，顯著降低機(jī)械傷引起的微生物病害問(wèn)題，抑制霉變。