陳謙，呂云龍，林芳卉

（1.內(nèi)江市種豬場(chǎng)，四川 內(nèi)江 641007；2.西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，重慶 榮昌 402460）

豬支原體肺炎（MPS），是由豬肺炎支原體感染豬引起的一種呼吸道傳染病。臨床上主要表現(xiàn)為咳嗽、被毛粗亂、呼吸加快、生長(zhǎng)發(fā)育受阻、飼料轉(zhuǎn)化率低等。特征性病理變化為豬肺部出現(xiàn)“對(duì)稱性蝦肉樣變”。單純豬肺炎支原體感染的死亡率一般不高，但通過抑制肺部免疫可以引發(fā)潛伏性、慢性支氣管肺炎，繼而被細(xì)菌、病毒等感染，在很大程度上促進(jìn)了豬呼吸道疾病綜合癥的發(fā)生，給規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)的豬群帶來嚴(yán)重的危害［1］。因此，控制豬場(chǎng)豬支原體感染是保證豬群健康的重要一環(huán)。

為了解內(nèi)江豬保種場(chǎng)種母豬肺炎支原體的感染情況，本試驗(yàn)采集內(nèi)江豬保種場(chǎng)未免疫種母豬的血液95 份，并分離血清，用ELISA 方法檢測(cè)豬肺炎支原體抗體；同時(shí)采集未免疫種母豬的鼻拭子95 份，提取豬肺炎支原體DNA，進(jìn)行豬肺炎支原體PCR擴(kuò)增，了解保種場(chǎng)種母豬肺炎支原體的帶菌情況［2-8］。根據(jù)兩種檢測(cè)結(jié)果，結(jié)合繁殖性能情況擬定淘汰計(jì)劃，為保種場(chǎng)豬肺炎支原體的防制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 被檢鼻拭子 隨機(jī)選擇未免疫的種母豬，用PBS 潤(rùn)濕無菌棉簽，將棉簽以45°左右插入豬鼻孔，輕輕旋轉(zhuǎn)，刺激豬打噴嚏，2個(gè)噴嚏過后，輕輕拔出棉簽，放入1.5 mL裝有PBS的離心管中，密閉冰袋保存，置-20 ℃冰箱中備檢［9］。

1.2 被檢血清 隨機(jī)選擇未免疫的種母豬，前腔靜脈采血3～5 mL，室溫靜置，待血清析出后，離心管3 000 r/min 離心10 min 分離血清，取上清液于-20 ℃保存待檢。

2 試驗(yàn)方法

2.1 鼻拭子PCR檢測(cè)

2.1.1 引物合成 采用李石等［10］報(bào)道的豬肺炎支原體P97基因，合成引物，片段大小為1 173 bp，引物序列分別如下：

上游引物：5′-TTGGTCTAACTGTCGGACTT-3′；下游引物：5′-CGCTTGCTGCATCTAGGCTATAT-3′。

送上海生工生物公司進(jìn)行合成。

2.1.2 豬肺炎支原體DNA 的提取 嚴(yán)格按寶生生物工程（大連）有限公司生產(chǎn)的細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書進(jìn)行。

2.1.3 PCR反應(yīng)體系及條件 豬肺炎支原體P97基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及條件見表1。

表1 PCR反應(yīng)體系及條件 μL

2.1.4 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳 5倍TBE緩沖液：450 mmol/L Tris-硼酸，10 mmol/L EDTA，pH 值8.0。使用時(shí)將其稀釋10 倍至0.5×TBE 緩沖液，可同時(shí)作為電泳及制膠用的緩沖液。根據(jù)制膠量及凝膠濃度標(biāo)準(zhǔn)制膠，取適量樣品與6×上樣緩沖液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中。加完樣后，合上電泳槽蓋，立即接通電源。控制電壓保持在110 V，電流在40 mA以上。當(dāng)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿約2 cm 時(shí)（耗時(shí)約40 min），停止電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中拍照并觀察結(jié)果。

2.2 血清ELISA抗體檢測(cè) 操作方法、結(jié)果判定嚴(yán)格按上海酶聯(lián)生物科技有限公司生產(chǎn)的豬肺炎支原體ELISA抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 種母豬鼻拭子豬肺炎支原體P97 PCR擴(kuò)增結(jié)果 通過PCR 擴(kuò)增，得到與P97 大小相符的核酸片段，為1 173 bp。在95份鼻拭子中，有5份為陽性，陽性率為5.26%。詳見表2。

表2 種母豬肺炎支原體PCR及ELISA抗體檢測(cè)結(jié)果

3.2 種母豬肺炎支原體血清ELISA 抗體檢測(cè)結(jié)果 用ELISA 方法檢測(cè)95 份未免疫種母豬的肺炎支原體血清抗體，結(jié)果有40 份陽性，55 份陰性，陽性率為42.10%。詳細(xì)結(jié)果見表2。

4 分析與討論

4.1 根據(jù)豬肺炎支原體P97 基因保守序列設(shè)計(jì)的引物對(duì)豬肺炎支原體進(jìn)行診斷，克服了豬肺炎支原體培養(yǎng)困難、血清學(xué)檢測(cè)中豬肺炎支原體與豬鼻支原體易發(fā)生交叉反應(yīng)的缺點(diǎn)，可見通過P97基因PCR診斷豬肺炎支原體是一種十分可靠的方法。本試驗(yàn)采用PCR 法檢測(cè)了內(nèi)江豬保種場(chǎng)未免疫母豬的鼻拭子95 份，結(jié)果顯示鼻拭子PCR檢測(cè)豬肺炎支原體的陽性率為5.26%。有報(bào)道用PCR方法對(duì)303份鼻拭子樣品進(jìn)行豬肺炎支原體檢測(cè)，結(jié)果陽性率為12.5%。本試驗(yàn)與上述報(bào)道相比，陽性檢出率較低，其原因可能是隨著豬肺炎支原體感染日期的增加，感染豬不排菌或者豬鼻排出的豬肺炎支原體達(dá)不到檢測(cè)的量。武昱孜等［11］用PCR 檢測(cè)方法對(duì)72 份支氣管肺泡灌洗液進(jìn)行了豬肺炎支原體檢測(cè)，陽性率為58.33%；馬曉迪等［12］用PCR 檢測(cè)方法對(duì)550 份支氣管肺泡灌洗液進(jìn)行了豬肺炎支原體檢測(cè)，陽性率為50%。從上述報(bào)道結(jié)果看，豬肺炎支原體在支氣管肺泡灌洗液中的檢出率均比鼻拭子中的高。由此可以看出，雖然鼻拭子PCR在豬早期感染時(shí)具有一定作用，但是受制于感染日期和采樣部位，可能導(dǎo)致漏診。因此，鼻拭子PCR 用于豬肺炎支原體診斷時(shí)應(yīng)與其他方法結(jié)合進(jìn)行。

4.2 本試驗(yàn)采用ELISA 對(duì)95 份未免疫種母豬的血清進(jìn)行抗體檢測(cè)，結(jié)果顯示感染率為42.1%。楊莉等［13］對(duì)貴州省六個(gè)地區(qū)13 327 份樣品進(jìn)行豬肺炎支原體血清學(xué)調(diào)查，結(jié)果感染率為30%；師麗敏等［14］對(duì)海南省?？谑胁糠值貐^(qū)的212份血清樣品進(jìn)行豬肺炎支原體抗體檢測(cè)，結(jié)果陽性率為50.6%；李石等［10］對(duì)新疆北疆地區(qū)456 份樣品進(jìn)行豬肺炎支原體血清學(xué)調(diào)查，結(jié)果感染率為50.44%。上述報(bào)道與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致，說明內(nèi)江豬保種場(chǎng)的種母豬感染肺炎支原體比較嚴(yán)重，需進(jìn)一步采取防控措施。

4.3 本試驗(yàn)中鼻拭子PCR檢測(cè)陽性率為5.26%，血清ELISA 抗體檢測(cè)陽性率為42.1%，兩種檢測(cè)方法的結(jié)果差異較大，ELISA 抗體檢測(cè)陽性率明顯高于PCR，究其原因可能與豬感染肺炎支原體后隨著抗體的產(chǎn)生，機(jī)體內(nèi)肺炎支原體逐漸被清除有關(guān)；另外一個(gè)原因是隨著感染日期的延長(zhǎng)，豬肺炎支原體從鼻咽部遷移到支氣管乃至肺泡內(nèi)，因此鼻咽拭子的檢出率較低。這也與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的豬肺炎支原體在支氣管肺泡灌洗液中檢出率最高相符合［15-16］。