范文忠 馮時(shí) 姜仁婧 楊雪 呂雪 黎浩然

(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林省吉林市，132101) (吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)) (吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院)

紫穗槐(Amorphafruticosa)又叫棉槐，是豆科、紫穗槐屬1種抗寒、抗旱、耐濕、耐鹽堿、抗風(fēng)沙、抗逆性極強(qiáng)的灌木。紫穗槐是北方重要綠化樹木，種植面積不斷擴(kuò)大，其病害極少發(fā)生；但筆者自2015—2018年調(diào)查發(fā)現(xiàn)，每年7月下旬到8月上旬，吉林省吉林市區(qū)、蛟河、安圖、延吉道路兩側(cè)綠化樹紫穗槐以及黑龍江省哈爾濱到佳木斯道路兩側(cè)紫穗槐葉斑病發(fā)病率在85%以上，嚴(yán)重時(shí)病葉紛紛脫落，影響了植株的健康和美觀，為此進(jìn)行了紫穗槐葉斑病病原菌生物學(xué)特性及藥劑敏感性研究。

1 材料與方法

1.1 紫穗槐葉斑病病原菌的分離

病樣采集和病原菌的分離純化：多點(diǎn)觀察紫穗槐葉斑病自然發(fā)生情況，記錄病害的發(fā)病部位，典型癥狀(病斑的顏色、形狀等)；采用組織分離法[1-2]進(jìn)行病原菌分離與純化；在不同地點(diǎn)共采集紫穗槐葉斑病病葉460份，組織分離法分離純化病菌，并保存。

致病性測(cè)定：按照柯赫氏法則進(jìn)行試驗(yàn)，將分離純化的病菌回接于200片微傷口的健葉上，調(diào)查發(fā)病情況，分離致病病原菌株(Zi)。

病原菌形態(tài)學(xué)鑒定：將菌株(Zi)接種在PDA培養(yǎng)基上，記錄菌落特征，觀察產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、分生孢子形態(tài)特征[3-9]。

1.2 分子生物學(xué)鑒定

病原菌rDNA ITS片段的PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定：采用試劑盒法[10-11]。ITS目的片段引物為ITS1，5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。TEF-1α目的片段引物為EF595F，5′-CCGATCTTGTAGACGTCCTG-3′；EF1160R，5′-CGTGACTTCATCAAGAACAT-3′。RPB2目的片段引物為fRPB2-5F，5′-GAYGAYMGWGATCAYTTYGG-3′；fRPB2-7cR，5′-CCCATRGCTTGYTTRCCCAT-3′。序列測(cè)定由上海生工生物工程有限公司完成。

序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建：將所得多個(gè)基因片段的序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行比對(duì)，采用多基因拼接，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 病原菌生物學(xué)特性測(cè)定

1.3.1不同碳、氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)影響的測(cè)定

菌絲生長(zhǎng)：以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別以等摩爾質(zhì)量的葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、D-果糖為碳源，將純化的病原菌培養(yǎng)5 d，用打孔器打直徑5 mm的菌餅，倒置接種在不同的PDA培養(yǎng)基中央，每皿1塊菌餅；以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別以等摩爾質(zhì)量的硝酸鉀、硝酸鈉、硝酸鈣、氯化銨、尿素為氮源，將菌餅倒置接種于不同查氏培養(yǎng)基上。不同碳、氮源分別設(shè)置5個(gè)處理，每處理4皿，25 ℃暗培養(yǎng)5 d，十字交叉法測(cè)量菌落直徑[12-13]。

孢子萌發(fā)：以等摩爾質(zhì)量的D-果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖為碳源，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%碳源溶液；以等摩爾質(zhì)量的氯化銨、硝酸鈉、硝酸鉀、尿素、硝酸鈣為氮源，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%氮源溶液，制備孢子菌懸液；設(shè)清水為對(duì)照。采用玻片萌發(fā)法，在顯微鏡下鏡檢孢子萌發(fā)數(shù)量，每小時(shí)觀察1次，直至任一處理的孢子萌發(fā)趨近100%時(shí)，試驗(yàn)結(jié)束，并計(jì)算孢子萌發(fā)率[14-16]。

1.3.2 不同溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)影響的測(cè)定

溫度分別設(shè)定15、20、25、30、35 ℃，將致病菌菌株5 mm菌餅倒置接種在PDA培養(yǎng)基中央，測(cè)定不同溫度下菌絲生長(zhǎng)情況；配制體積分?jǐn)?shù)2%葡萄糖-孢子菌懸液，測(cè)定孢子萌發(fā)情況[17-18]；菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)分別設(shè)置5個(gè)處理，每處理4皿；菌落直徑、孢子萌發(fā)測(cè)試方法同1.3.1。

1.3.3 不同pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)影響的測(cè)定

采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% NaOH溶液、體積分?jǐn)?shù)0.1% HCl溶液調(diào)節(jié)pH值，pH值分別設(shè)定為5、6、7、8、9，分別配制不同pH值的PDA培養(yǎng)基、體積分?jǐn)?shù)2%葡萄糖-孢子菌懸液，設(shè)5個(gè)處理，每處理4皿，25 ℃暗培養(yǎng)；菌落直徑、孢子萌發(fā)測(cè)試方法同1.3.1。

1.3.4 不同光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)影響的測(cè)定

設(shè)定光照為24 h全光照、12 h-12 h光暗交替、24 h全黑暗，以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，將致病菌菌株5 mm菌餅倒置接種在PDA培養(yǎng)基中央，測(cè)定不同光照條件下菌絲生長(zhǎng)情況；配制體積分?jǐn)?shù)2%葡萄糖-孢子菌懸液，測(cè)定孢子萌發(fā)情況，分別設(shè)置3個(gè)處理，每處理4皿；菌落直徑、孢子萌發(fā)測(cè)試方法同1.3.1。

1.4 室內(nèi)藥劑篩選

1.4.1 供試菌株及藥劑

供試菌株：紫穗槐葉斑病致病菌(Zi)。

供試藥劑：250 g·L-1嘧菌酯SC、質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%代森錳鋅WP、500 g·L-1氟啶胺SC、質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% IR9792 SC、質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%氟菌唑WP、430 g·L-1戊唑醇SC、125 g·L-1氟環(huán)唑SC、250 g·L-1啶氧菌酯SC、質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%啶酰菌胺WG、250 g·L-1吡唑醚菌酯EC、質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%氟硅唑ME、質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%苯醚甲環(huán)唑WG、250 g·L-1丙環(huán)唑EC(市售)。

1.4.2 試驗(yàn)方法

采用生長(zhǎng)速率法，在室內(nèi)測(cè)試13種殺菌劑對(duì)供試菌株的敏感性。在無(wú)菌條件下，將每種藥劑分別配制100、200、300、500、1 000、2 000 mg·kg-1的處理劑量，每1 mL藥劑加9 mL PDA培養(yǎng)基，制作含藥培養(yǎng)基，無(wú)菌水為對(duì)照，每處理重復(fù)4次；用打孔器打取5 mm菌餅，菌餅菌絲面朝下置于含藥培養(yǎng)基中央，5 d后十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑制率[19-22]。最小二乘法建立毒力回歸方程，求出EC50。

抑制率={(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照

菌落直徑}×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫穗槐葉斑病發(fā)病癥狀

紫穗槐葉斑病主要危害紫穗槐葉片，發(fā)病初期葉片上形成褐色至黑褐色近圓形小病斑，大小為0.5～2.5 mm，后期病斑數(shù)量增加，有些病斑連在一起，形成不規(guī)則大病斑，病斑延伸到葉柄部，致葉片枯死、脫落，紫穗槐葉斑病田間及病葉危害狀見圖1。

2.2 致病性

將不同地區(qū)采集的460份發(fā)病葉片，經(jīng)室內(nèi)多次組織分離，得到4個(gè)菌株。在光學(xué)顯微鏡下初步鑒定，分別屬于葡萄孢菌屬2種，鏈格孢菌屬1種，枝孢霉屬1種。按照柯赫氏法則進(jìn)行試驗(yàn)，接種20 d后，接種葡萄孢菌屬(2種)葉片均未發(fā)病；接種枝孢霉屬(1種)的葉片零星發(fā)病，發(fā)病率5%以下，癥狀與接種前采集的病葉差異較大，采集病葉分離未得到接種的枝孢霉，枝孢霉屬二次回接，未發(fā)病；接種鏈格孢菌屬(1種)發(fā)病嚴(yán)重，發(fā)病率達(dá)85%，發(fā)病癥狀同各地采集的病葉癥狀相同，接種后病葉分離純化病原物，其菌落及孢子形態(tài)與最初分離的病原物一致，將此病原物標(biāo)記為鏈格孢Zi菌株；病原物Zi菌株再次按照柯赫氏法則進(jìn)行試驗(yàn)，獲得相同結(jié)果。

2.3 病原菌分子生物學(xué)

病原菌鏈格孢Zi菌株ITS擴(kuò)增序列545 bp，TEF-1α序列785 bp，RPB2序列883 bp。經(jīng)Blast比對(duì)分析與Alternariaalternata相似度達(dá)到99%。系統(tǒng)發(fā)育樹分析該病原菌與Alternariaalternata(CBS 916.96、CBS 106.24、CBS 104.26、CBS 154.31、CBS 117.44)親緣關(guān)系較近，其形態(tài)特征又完全符合Alternariaalternata?；贗TS、TEF-1α、RPB2聯(lián)合以NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，將致病菌鏈格孢Zi菌株確定為互隔交鏈孢(Alternariaalternata)。

2.4 病原菌落形態(tài)

在PDA培養(yǎng)基上，紫穗槐葉斑病菌菌絲初為白色，氣生菌絲生長(zhǎng)旺盛，呈放射狀向外擴(kuò)展，后期菌絲顏色逐漸加深，變?yōu)榛疑蚧液稚錇閳A形，菌絲稠密。

病原形態(tài)：分生孢子單生或者短鏈生狀，淡褐色，呈倒棒狀至卵形，具有1～4個(gè)橫隔，成熟孢子多為3個(gè)橫膈，0～4個(gè)縱、斜隔膜，孢身長(zhǎng)22.2～51.8 μm，寬13.3～22.2 μm。分生孢子梗單生或者簇生，直立或者屈膝狀彎曲，褐色，具有分隔，著生有1至數(shù)個(gè)孢痕，長(zhǎng)12.59～24.44 μm，寬2.59～5.93 μm，具有柱狀的喙，淡褐色；依據(jù)分子鑒定和形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，明確病原，紫穗槐葉斑病致病菌為互隔交鏈孢(Alternariaalternata)，致病菌病原形態(tài)見圖3。

2.5 生物學(xué)特性

2.5.1 不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)的影響

由表1可見，對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響，葡萄糖處理與其他處理間差異極顯著，說明葡萄糖更適合菌絲的生長(zhǎng)；對(duì)孢子萌發(fā)影響，蔗糖處理與其他處理間差異極顯著，說明蔗糖更適合孢子萌發(fā)。

表1 不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)及孢萌發(fā)的影響

2.5.2 不同氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)的影響

由表2可見，對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響，硝酸鈉處理與其他處理間差異極顯著，說明適合菌絲生長(zhǎng)的氮源是硝酸鈉；對(duì)孢子萌發(fā)影響，硝酸鈉、硝酸鈣處理與其他處理間差異極顯著，適宜孢子萌發(fā)的氮源是硝酸鈉、硝酸鈣。

2.5.3 不同pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)的影響

由表3可見，pH=7時(shí)，菌落直徑、孢子萌發(fā)率均極顯著大于其他處理(P<0.01)，說明中性環(huán)境最適合孢子萌發(fā)及菌絲生長(zhǎng)。

表2 不同氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)的影響

表3 不同pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)的影響

2.5.4 不同溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)的影響

由表4可知，25 ℃時(shí)，菌落直徑極顯著大于與其他處理(P<0.01)；30 ℃時(shí)，孢子萌發(fā)率極顯著高于其他處理(P<0.01)，表明25 ℃最適合菌絲生長(zhǎng)，而30 ℃是孢子萌發(fā)的最適溫度。

表4 不同溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)的影響

2.5.5 不同光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)的影響

由表5可見，對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響，12 h-12 h光暗交替處理與其他處理間差異極顯著，最適合菌絲生長(zhǎng)；對(duì)孢子萌發(fā)影響，24 h全黑暗處理與其他處理間差異極顯著，最適合孢子萌發(fā)。

表5 不同光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)的影響

2.6 室內(nèi)藥劑敏感性

由表6可知，EC50值越小，致病菌對(duì)藥劑越敏感，質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%丙環(huán)唑EC、質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%苯醚甲環(huán)唑WG的EC50值分別為84.97、95.99 mg·L-1，敏感性較高，其次為質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%氟硅唑ME、質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% IR9792 SC、125 g·L-1氟環(huán)唑SC、250 g·L-1啶氧菌酯SC，EC50值分別為264.11、290.33、305.90、350.82 mg·L-1。由此可見，防治紫穗槐葉斑病時(shí)，優(yōu)選質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%丙環(huán)唑EC、質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%苯醚甲環(huán)唑WG，其次是質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%氟硅唑ME、質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% IR9792 SC、125 g·L-1氟環(huán)唑SC、250 g·L-1啶氧菌酯SC。

表6 紫穗槐葉斑病病菌對(duì)不同殺菌劑的敏感性

3 結(jié)束語(yǔ)

互隔交鏈孢可以危害植物的莖、葉子、種子等，是危害植物的主要病原之一，可侵染多種植物，使植物莖、葉的腐爛萎蔫，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近年來利用特異性引物、特征DNA序列等分子技術(shù)輔助鑒定病原菌的方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，ITS序列分析是目前真菌種屬鑒定中應(yīng)用最早、最多的方法。本試驗(yàn)明確了紫穗槐葉斑病致病菌為互隔交鏈孢，并對(duì)其生物特性進(jìn)行了研究，同時(shí)室內(nèi)測(cè)定了13種殺菌劑對(duì)該病原菌的抑制作用。結(jié)果表明，具有保護(hù)和治療作用的三唑類殺菌劑，可以有效地控制葉斑病的發(fā)生；在防治紫穗槐葉斑病時(shí)，可優(yōu)選質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%丙環(huán)唑EC、質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%苯醚甲環(huán)唑WG，其次是質(zhì)量分?jǐn)?shù)分?jǐn)?shù)8%氟硅唑ME、質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% IR9792 SC、125 g·L-1氟環(huán)唑SC。此外，對(duì)紫穗槐葉斑病病原經(jīng)多次分離得4個(gè)菌株，柯赫氏法則進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，有且僅有互隔交鏈孢菌株在接種后發(fā)病，再次分離得相同菌株，所得菌株數(shù)量相對(duì)單一，可能與紫穗槐本身的抗性有關(guān)，這與其他相關(guān)鏈格孢菌分離與鑒定存在差異，這種差異性還需要進(jìn)一步研究，對(duì)于紫穗槐葉斑病菌(Alternariaalternata)是否侵染其他植物還需要探討。