李北　汪浩勇　William Wang　李永恒　郭春雷　黃加軍

摘????? 要：運(yùn)動發(fā)酵單胞菌通過ED途徑高效轉(zhuǎn)化單糖生成乙醇，其生長不需氧氣，能夠以N₂作為氮源，抗逆性強(qiáng);其乙醇發(fā)酵速度快，乙醇理論產(chǎn)率高，生產(chǎn)周期較短和原料利用率較高，容易進(jìn)行基因工程改造。本文采用水稻和木薯為乙醇發(fā)酵的原料，研究重組運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的發(fā)酵特點(diǎn)，驗(yàn)證其乙醇發(fā)酵性能，為其今后在乙醇生產(chǎn)中實(shí)際使用積累經(jīng)驗(yàn)和提供參考依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，與安琪超級釀酒干酵母相比，在重組運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的乙醇發(fā)酵過程中，CO₂產(chǎn)量更低導(dǎo)致發(fā)酵失重更少，乙醇產(chǎn)量明顯增加，最佳發(fā)酵溫度更高，淀粉出酒率更高和淀粉利用率更高。重組運(yùn)動發(fā)酵單胞菌對安菌泰和青霉素有較強(qiáng)的耐受性，乙醇發(fā)酵指數(shù)期大約為0～40 h，種子擴(kuò)大培養(yǎng)期間不需要添加任何外來氮源。

關(guān)? 鍵? 詞：運(yùn)動發(fā)酵單胞菌;乙醇發(fā)酵;水稻;木薯

中圖分類號：TQ 920.6???? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A?????? 文章編號： 1671-0460（2020）07-1400-06

Study on Ethanol Fermentation Effect of Recombinant Zymomonas Mobilis

LI Bei 1*， WANG Haoyong 2*， William Wang 3 ， LI Yongheng 1， GUO Chunlei 1， HUANG Jia-jun1

（1. Guangxi COFCO Bio-energy Co.， Ltd.， Beihai Guangxi 536100，China;

2. Key Laboratory of Fermentation Engineering of Ministry of Education， Hubei University of Technology，

Wuhan Hubei 410068， China;

3. Harriton High School，?Rosemont PA USA 19010; *· Contributed equally to this work）

Abstract： Zymomonas mobilis can efficiently transform monosaccharides to produce ethanol through ED pathway. Its growth does not require oxygen， can use N2 as a nitrogen source and is highly resistant to stress. Its ethanol fermentation speed is fast and the production cycle is short. Its theoretical ethanol yield is high and the raw material utilization rate is high. It is easy to carry out gene manipulation for genetic transformation. In this paper， ethanol fermentation of new typed recombinant Z. mobilis strains was studied by using rice or cassava as raw materials. Compared with the Angel yeast of Saccharomyces cerevisiae， in the ethanol fermentation process， the CO2 production of the Z. mobilis is significantly lower， and the ethanol production is significantly higher. Its optimal fermentation temperature is higher， starch liquor yield and starch utilization rate are significantly higher， and acid production is lower. It has a strong tolerance to Penicillin. The ethanol fermentation index period is between 0～ 40 h， and no external nitrogen source is needed during its seed expansion cultivation.

Key words： Zymomonas mobilis; Ethanol fermentation; Rice; Cassava

與酵母菌乙醇發(fā)酵的代謝途徑不同， 運(yùn)動發(fā)酵單胞菌^[1]（Zymomonas mobilis， Z. mobilis）通過ED途徑高效轉(zhuǎn)化葡萄糖和果糖生產(chǎn)乙醇。Z. mobilis具有菌體生長少、生長不需氧氣、能夠?qū)₂作為氮源^[2]、副產(chǎn)物少、乙醇耐受力和溫度耐受力強(qiáng)、具有良好的遺傳改良性等特征，其乙醇發(fā)酵速度和產(chǎn)乙醇理論值均高于酵母菌，生產(chǎn)周期短和原料利用率高。Z. mobilis長期被寄予厚望，有希望成為跟酵母一樣大量使用的乙醇發(fā)酵菌種。

采用合成生物學(xué)技術(shù)，湖北工業(yè)大學(xué)汪浩勇教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)出了能在無蛋白培基中高速、高效、高密度發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的重組Z. mobilis菌種^[3-8]。在無氨基酸無維生素的化學(xué)培養(yǎng)基中，這些新Z. mobilis能高效利用木糖、阿拉伯糖、甘露糖或葡萄糖來高產(chǎn)乙醇;在營養(yǎng)合適和優(yōu)化的培養(yǎng)基中，利用上述各種單糖及其任意糖的組合，新Z. mobilis的乙醇產(chǎn)量接近最高理論值。該細(xì)菌可以高效利用含有大量木糖的農(nóng)作物秸稈制備乙醇，乙醇產(chǎn)量接近木糖或葡萄糖的最高理論產(chǎn)值。

與安琪超級釀酒干酵母進(jìn)行對比，使用上述重組菌種，本項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖茄芯啃?em>Z. mobilis的發(fā)酵特點(diǎn)，驗(yàn)證其發(fā)酵性能以及使用可行性，為今后乙醇生產(chǎn)使用新Z. mobilis提供參考依據(jù)。

1? 試驗(yàn)內(nèi)容

1.1? 菌株

重組Z. mobilis菌種（D號、E號、4號、6號、9號、616號），來源于湖北工業(yè)大學(xué)汪浩勇教授實(shí)驗(yàn)室。安琪超級釀酒高活性干酵母，來源于宜昌安琪酵母股份有限公司。

1.2? 材料與試劑

木薯，廣西地區(qū)種植加工的干片;a-淀粉酶（10萬U·g^-1），諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司;尿素，安徽金禾化工有限公司;青霉素，石家莊華北制藥股份有限公司;安菌泰，柳州龍?zhí)┛萍加邢薰?鹽酸，濟(jì)南坤豐化工有限公司; 硫酸，廣西銀泉化工有限責(zé)任公司;氫氧化鈉、次甲基藍(lán)指示劑、斐林試劑、酚酞指示劑，廣西天地?fù)P生物科技有限公司。

1.3? 儀器與設(shè)備

上海百侖生物50 L全自動三聯(lián)發(fā)酵罐，高效液相色譜（HPLC），全自動進(jìn)樣頂空高效氣相色譜儀，快速水分測定儀，恒溫?fù)u床，恒溫培養(yǎng)箱，恒溫水浴鍋，高速離心機(jī)，酸度計，電子分析天平，可控溫電爐，容量瓶，三角瓶，離心管，量筒，移液槍，燒杯，玻璃棒，高壓滅菌鍋，無菌操作臺，針筒式濾膜過濾器，722 可見分光光度計，pH 計。

1.4? 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1? 木薯原料菌種活化

取木薯粉配制固形物含量28%的粉漿，調(diào)節(jié)pH至5.60左右，添加杰能科淀粉酶（0.1 kg·t^-1木薯）進(jìn)行液化，87～90 ℃液化2.5 h，冷卻后調(diào)節(jié)pH至4.40左右，添加隆科特糖化酶（1.0 kg·t^-1木薯），60 ℃糖化40 min，然后冷卻，分裝至三角瓶，添加尿素（1.3 kg·t^-1木薯）和菌種（2%液化醪）搖勻，用發(fā)酵栓封口，于34 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，得到菌種活化液。

1.4.2 ?木薯原料發(fā)酵試驗(yàn)

取木薯粉配制固形物含量28%的粉漿，調(diào)節(jié)pH至5.60左右，添加杰能科淀粉酶（0.1 kg·t^-1木薯）進(jìn)行液化，87～90 ℃液化2.5 h，冷卻后調(diào)節(jié)pH至4.40左右，添加隆科特糖化酶（1.0 kg·t^-1木薯），60 ℃糖化4 0 min，然后分裝至三角瓶，添加尿素（1.3 kg·t^-1木薯）和菌種（2%液化醪）搖勻，用發(fā)酵栓封口，稱重，發(fā)酵70 h，發(fā)酵結(jié)束檢測發(fā)酵指標(biāo)，同時進(jìn)行液相檢測分析，并計算淀粉出酒率和淀粉利用率^[9]。

1.4.3? 水稻原料菌種活化

車間取二冷水稻液化醪，將pH值調(diào)至4.40左右，添加隆科特糖化酶（1.0 kg·t^-1水稻）60 ℃糖化40 min，然后分裝至三角瓶，添加尿素（1.3 kg·t^-1水稻）和菌種（2%液化醪）搖勻，用發(fā)酵栓封口，稱重，于34 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，得到菌種活化液。

1.4.4? 水稻原料菌種發(fā)酵

車間取二冷水稻液化醪，將pH值調(diào)至4.40左右，添加隆科特糖化酶（1.0 kg·t^-1水稻）60 ℃糖化40 min，然后分裝至三角瓶，添加尿素（1.3 kg·t^-1水稻）和菌種（2%液化醪）搖勻，用發(fā)酵栓封口，稱重，發(fā)酵70 h，發(fā)酵結(jié)束檢測發(fā)酵指標(biāo)，同時進(jìn)行液相檢測分析，并計算淀粉出酒率和淀粉利用率^[10]。

1.4.5 ?分析檢測

采用酶解法測定淀粉含量;采用斐林試劑熱滴定定糖法測定還原糖、總糖的含量;采用血球計數(shù)板法檢測酵母質(zhì)量;采用乙醇廠常用方法測定外觀糖度、乙醇度、揮發(fā)酸、酸度等。

1.4.6? 淀粉出酒率和淀粉利用率計算公式

淀粉出酒率% =

（產(chǎn)酒體積分?jǐn)?shù)%×乙醇密度）/淀粉含量×100%

淀粉利用率% = 淀粉出酒率%/理論出酒率%×100%

2? 結(jié)果與討論

2.1? 乙醇發(fā)酵過程失重動態(tài)圖

乙醇發(fā)酵是一個微生物將單糖分解、不斷生成乙醇及CO₂的過程。除極少量溶解于發(fā)酵醪中外，絕大部分CO₂逃逸造成失重。根據(jù)發(fā)酵過程中CO₂氣體排放量即失重動態(tài)，可以比較準(zhǔn)確地把握乙醇發(fā)酵進(jìn)程的狀態(tài)。

分別在33 ℃或36 ℃條件下進(jìn)行乙醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，設(shè)立不用抗生素、使用安菌泰或使用青霉素3種實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，在6種不同的乙醇發(fā)酵條件下，大約在0～40 h期間，Z. mobilis乙醇發(fā)酵處于指數(shù)期，在此期間失重量以幾何級數(shù)增加，這可能因?yàn)榇藭r期的微生物生長、發(fā)酵物底物和外界環(huán)境處于最佳狀態(tài)。大約40 h以后，乙醇發(fā)酵進(jìn)入穩(wěn)定期，然后迅速進(jìn)入靜止期，失重和乙醇生成速度大幅減緩，這可能因?yàn)闋I養(yǎng)的消耗使?fàn)I養(yǎng)物比例失調(diào)、有害代謝產(chǎn)物積累、pH值等理化條件不適宜。

2.2? 種子擴(kuò)大培養(yǎng)期間使用糖化酶對乙醇產(chǎn)量的影響

現(xiàn)代乙醇發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)的每只發(fā)酵罐的容積一般有幾百甚至幾千立方米，因此要在短時間內(nèi)完成發(fā)酵，必須要有數(shù)量巨大的微生物細(xì)胞才行。種子擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù)就是要獲得數(shù)量足夠的健壯的微生物，是指將處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入種子罐進(jìn)行培養(yǎng)，從而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程，可以導(dǎo)致產(chǎn)率顯著提高，雜菌污染的防止效果也更高了。

? ?糖化酶又稱葡萄糖淀粉酶，它能把淀粉從非還原性未端水解a-1.4葡萄糖苷鍵產(chǎn)生葡萄糖;也能緩慢水解a-1.6葡萄糖苷鍵，轉(zhuǎn)化為葡萄糖;同時也能水解糊精和糖原的非還原末端釋放β-D-葡萄糖。糖化酶導(dǎo)致產(chǎn)生可供細(xì)菌生長和發(fā)酵性的糖類。

本實(shí)驗(yàn)的微生物擴(kuò)培時，液化醪先經(jīng)過添加糖化酶或不添加糖化酶兩種方法處理，上述糖化液經(jīng)過無菌分裝入不同的三角燒瓶，各瓶按2%液化醪的比例分別加入一種微生物后，進(jìn)行34 ℃過夜擴(kuò)培，共獲得8種Z. mobilis活化菌種。然后擴(kuò)培的微生物按2%的比例加入水稻糖化醪進(jìn)行乙醇發(fā)酵，經(jīng)過34 ℃發(fā)酵72 h后，對發(fā)酵液進(jìn)行測定，結(jié)果如表1所示。由表1可以看出，在相同發(fā)酵條件下，Z. mobilis產(chǎn)乙醇的濃度明顯高于安琪酵母;在微生物擴(kuò)大培養(yǎng)過程中，使用或不使用外源的糖化酶，細(xì)菌發(fā)酵生成乙醇的濃度并沒有顯著差異，因此活化階段糖化酶的使用與否對細(xì)菌乙醇產(chǎn)量影響不大。結(jié)果表明這些Z. mobilis本身可能具有自我合成高活性的糖化酶的能力。

2.3? 添加不同氮源對乙醇產(chǎn)量影響

微生物的生長和產(chǎn)物合成需要氮源，氮源主要用于菌體細(xì)胞物質(zhì)（氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等）和含氮代謝物的合成。乙醇發(fā)酵常用的添加氮源包括硫酸銨和尿素。

由于缺乏足夠的氮元素，利用酵母發(fā)酵纖維素生產(chǎn)乙醇時，經(jīng)常需要補(bǔ)充NH₄⁺和工業(yè)用氮補(bǔ)充劑。而Z. mobilis能夠僅使用N₂氣作為氮源就可以不犧牲乙醇產(chǎn)量?；蚪M學(xué)證據(jù)表明，N₂固定可能是許多Z. mobilis菌株的保守性狀。例如菌株ATCC 29192，似乎具有額外的N₂固定多功能性，除了Mo-硝化酶外還編碼Fe-硝化酶。Z. mobilis固氮特點(diǎn)帶來的經(jīng)濟(jì)和環(huán)境效益，將顯著降低纖維素乙醇的生產(chǎn)成本。從表2可以看出，616號菌株似乎具有較強(qiáng)的N₂固定功能性，對于水稻糖化醪，不需要添加任何外來氮源，616號菌株就能高產(chǎn)乙醇。

2.4? 抗生素對細(xì)菌的影響

乙醇發(fā)酵工業(yè)經(jīng)常遭受著雜菌污染的威脅。凡是在發(fā)酵液或發(fā)酵容器中侵入了非接種的微生物統(tǒng)稱為雜菌污染，雜菌污染后輕者影響產(chǎn)率、產(chǎn)物提取收得率和產(chǎn)品質(zhì)量，重者造成“倒罐”，不但浪費(fèi)大量原材料，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，還會對周圍環(huán)境造成破壞。加入適量的抗生素或殺菌劑，對減少由雜菌污染造成的損失至關(guān)重要。

采用安菌泰和青霉素作為抑菌劑，同時設(shè)立了無抑菌劑對照組和安琪酵母發(fā)酵添加安菌泰的對照組，本試驗(yàn)對4號菌Z. mobilis和安琪酵母同時進(jìn)行33 ℃和36 ℃的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

試驗(yàn)結(jié)果表明，在相同發(fā)酵條件下，Z. mobilis的失重明顯低于安琪酵母，并且最終乙醇的濃度也明顯高于安琪酵母。Z. mobilis乙醇增產(chǎn)的原因，可能是由于發(fā)酵過程產(chǎn)生的CO₂比酵母較少而引起的。

在不同溫度條件下，使用或者不使用安菌泰或青霉素，Z. mobilis發(fā)酵生成乙醇的濃度并沒有顯著差異，表明Z. mobilis對安菌泰和青霉素有較強(qiáng)的耐受性，其發(fā)酵過程不被一般濃度的安菌泰和青霉素抑制。因此，為了保險起見時，可以用安菌泰和青霉素來抑制Z. mobilis乙醇發(fā)酵過程中污染的雜菌。

2.5? 細(xì)菌發(fā)酵木薯和水稻小試

此實(shí)驗(yàn)采用木薯和水稻為原料，發(fā)酵重量為400 g，使用Z. mobilis D號菌和E號菌種，同時設(shè)安琪酵母為對照，進(jìn)行了兩批試驗(yàn)，取兩批試驗(yàn)結(jié)果平均值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

從殘?zhí)欠治觯?個菌種發(fā)酵結(jié)果沒有太大差別。從產(chǎn)酸來看，3者揮發(fā)酸的區(qū)別不大，而酸度對比，D菌種和E菌種發(fā)酵的酸度明顯比安琪發(fā)酵的酸度低。

水稻原料發(fā)酵中，三者的殘淀粉基本一致，殘糊精則是安琪酵母的較低;木薯原料發(fā)酵中，D菌種和E菌種發(fā)酵的殘淀粉和殘糊精均比安琪酵母低，尤其是E菌種發(fā)酵殘淀粉比安琪發(fā)酵低33.8%，殘糊精低20.0%。

從圖2可看出，不管是用水稻原料還是用木薯原料，D菌種和E菌種的淀粉出酒率和淀粉利用率均比安琪發(fā)酵的高。D菌種水稻和木薯發(fā)酵的淀粉利用率分別比安琪發(fā)酵高4.82%和2.80%，E菌種水稻和木薯發(fā)酵的淀粉利用率分別比安琪發(fā)酵高5.07%和2.45%。

HPLC測定結(jié)果表5顯示，D菌種和E菌種發(fā)酵的酒分明顯比安琪酵母發(fā)酵的酒分高，D菌種水稻和木薯發(fā)酵分別比安琪發(fā)酵多產(chǎn)乙醇6.84%和4.30%，E菌種水稻和木薯發(fā)酵分別比安琪發(fā)酵多產(chǎn)乙醇6.78%和4.17%。

2.6? 50 L發(fā)酵罐發(fā)酵水稻生產(chǎn)乙醇

用水稻為原料，使用50 L全自動發(fā)酵罐進(jìn)行Z. mobilis 4號菌種乙醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，同時設(shè)安琪酵母為對照，我們2018年進(jìn)行了3批試驗(yàn)。

菌種活化過程如下：從車間取二冷32 ℃液化醪，調(diào)節(jié)pH至4.6左右，然后添加尿素（1.3 kg·t^-1水稻）、糖化酶（0.8 kg·t^-1水稻）、安菌泰（5 g·t^-1水稻）。取上述液化醪380 g置于無菌玻璃三角瓶中，加入Z. mobilis 4號菌種20 g，搖瓶振蕩混勻，密封。將三角瓶放入33 ℃恒溫箱，靜止培養(yǎng)過夜，檢測菌種培養(yǎng)液細(xì)菌數(shù)超過1.0億·mL^-1后，即可進(jìn)行乙醇發(fā)酵。

乙醇發(fā)酵過程如下：50 L發(fā)酵罐以及管道通蒸汽滅菌1 h后，加入40 kg二冷液化醪，調(diào)節(jié)pH至4.60左右，然后添加尿素（1.3 kg·t^-1水稻）、糖化酶（0.8 kg·t^-1水稻）、安菌泰（5 g·t^-1水稻），加入上一步驟的活化菌種400 g，發(fā)酵罐出氣管用水密閉，Z. mobilis發(fā)酵控溫至34 ℃，安琪酵母對照發(fā)酵控溫至33 ℃，緩慢攪拌發(fā)酵70 h。

采用蒸餾法和HPLC法對發(fā)酵液的乙醇濃度進(jìn)行了測定，以安琪酵母生產(chǎn)乙醇的實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果為對照，每批實(shí)驗(yàn)Z. mobilis增產(chǎn)結(jié)果如表6所示。

3? 結(jié)束語

采用安琪超級釀酒干酵母為對照，使用重組Z. mobilis，本實(shí)驗(yàn)分別以水稻和木薯為原料進(jìn)行了多批乙醇發(fā)酵，綜合化學(xué)檢測和液相檢測結(jié)果分析，可得出如下結(jié)論：

1）Z. mobilis乙醇發(fā)酵的指數(shù)期大約在0～40 h。菌種活化期間不需要添加任何外來氮源也可以高產(chǎn)乙醇。Z. mobilis發(fā)酵過程失重少，對安菌泰和青霉素有較強(qiáng)的耐受性。

2）以水稻或者木薯為原料發(fā)酵，Z. mobilis的乙醇發(fā)酵效果明顯比安琪發(fā)酵效果更好，產(chǎn)酒量更高，淀粉出酒率和淀粉利用率更高。

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基金項(xiàng)目： 廣西重點(diǎn)研發(fā)計劃，多元原料高效生產(chǎn)燃料乙醇關(guān)鍵技術(shù)與產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用示范（項(xiàng)目編號：桂科AB192245049）。

收稿日期： 2020-05-31

作者簡介： 李北（1963-），男，北京市人，高級工程師，碩士研究生，1997年畢業(yè)于對外經(jīng)濟(jì)貿(mào)易大學(xué)工商管理專業(yè)，研究方向：生物質(zhì)能源及資源化利用開發(fā)。E-mail：1827798776@163.com。

通訊作者： 汪浩勇（1964-），男，教授，博士研究生。E-mail：371809000@qq.com。