韓何丹,韓照玉,杜月梅,劉云帆,李艾琳,高麗萍

（北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院,生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100191）

肺癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率在眾多惡性腫瘤中增長(zhǎng)最快,并對(duì)人群健康及生命產(chǎn)生了巨大威脅[1],其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）在我國(guó)發(fā)病率和死亡率最高[2-4],且發(fā)病率逐年增高。目前,化療是臨床肺癌綜合治療的重要手段之一[5]。順鉑（cisplatin,DDP）作為廣譜抗腫瘤藥物,能與腫瘤細(xì)胞中DNA發(fā)生交叉聯(lián)結(jié),破壞DNA功能,從而能激活腫瘤細(xì)胞的凋亡途徑。對(duì)于晚期NSCLC,最常用的化療方案是以鉑類為基礎(chǔ)的雙藥聯(lián)合治療,但由于肺癌對(duì)化療藥物極易產(chǎn)生耐藥性,且DDP的長(zhǎng)期大劑量使用會(huì)造成患者強(qiáng)烈的不良反應(yīng),降低了臨床化療的效率[6]。因此,肺癌的化療耐藥性已成為臨床治療的熱點(diǎn)問(wèn)題。

枸杞多糖（Lycium barbarumpolysaccharides,LBP）是枸杞的主要有效成分之一,具有抗衰老、降血糖、降血脂和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用及抗腫瘤功效[7-8]。崔曉燕等[9]通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)LBP對(duì)HeLa細(xì)胞有明顯的抑制作用,并呈現(xiàn)劑量依賴性。研究表明,LBP對(duì)人前列腺癌DU145細(xì)胞、小鼠肝癌細(xì)胞H22瘤株均有不同程度抑制和促凋亡作用[10-12]。

前期研究結(jié)果顯示,LBP對(duì)DDP引起的腎毒性、生殖毒性均有良好的保護(hù)作用[13-14],而LBP對(duì)DDP抗癌作用的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立了A549 DDP損傷細(xì)胞模型并通過(guò)LBP-DDP聯(lián)合處理,探討LBP聯(lián)合DDP對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549損傷的影響及可能的作用機(jī)制,為L(zhǎng)BP在臨床發(fā)揮其抗癌作用并輔助DDP化療增敏作用提供理論依據(jù),以期提高癌癥患者的治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肺腺癌細(xì)胞A549 北京協(xié)和醫(yī)院基礎(chǔ)學(xué)院細(xì)胞中心。

DDP（注射用凍干粉劑） 山東齊魯制藥有限公司；LBP（純度≥99%） 南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司；DMEM/F12培養(yǎng)基、胰酶、CCK-8試劑盒、細(xì)胞凋亡試劑盒 美國(guó)Genview公司；胎牛血清 美國(guó)HyClone公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、Bax抗體、Bcl-2抗體、caspase-3抗體 博士德生物技術(shù)有限公司；β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G,IgG）抗體、山羊抗兔IgG抗體、高效化學(xué)發(fā)光（efficient chemiluminescence,ECL）試劑盒 北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；丙二醛（malondialdehyde,MDA）、谷胱甘肽（glutathione,GSH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所；活性氧（reaction oxygen species,ROS）檢測(cè)試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

FACS Calibar流式細(xì)胞儀 美國(guó)BD公司；多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司；WFZ UV-4802H紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯上海儀器有限公司；TE2000-M倒置顯微鏡 日本Nikon公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

A549細(xì)胞采用10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基,置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合度至80%～90%時(shí),胰酶消化,按1∶3進(jìn)行傳代培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 A549細(xì)胞增殖和CCK-8法測(cè)定

取100 μL（1×105個(gè)/mL）處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞接種到96 孔板中孵育,待細(xì)胞至融合狀態(tài)時(shí),棄原培養(yǎng)液,每孔加入含100 μL不同質(zhì)量濃度DDP（0、1、2、4、8、16、32、64、128 mg/L）的無(wú)血清培養(yǎng)基,每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔,在37 ℃、含5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,棄培養(yǎng)液,各孔加入100 μL含10% CCK-8的培養(yǎng)基,繼續(xù)孵育4 h,450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度A,按式（1）計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.3 LBP對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響

同1.3.1節(jié)的方法,將DDP換成不同質(zhì)量濃度的LBP（0、2、4、8、16、32、64、128 mg/L）,并按照式（1）計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.4 LBP聯(lián)合DDP用藥對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響

根據(jù)1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)計(jì)算所得DDP和LBP兩種藥對(duì)A549細(xì)胞的半抑制濃度（half-inhibitory concentration,IC50）,并基于兩者的IC50值,將DDP和LBP分別以兩種不同質(zhì)量濃度（6、12 mg/L DDP,8、16 mg/L LBP）組合。再用CCK-8法檢測(cè)存活率。另設(shè)不加藥對(duì)照組及LBP和DDP單獨(dú)用藥組,將100 μL（1×105個(gè)/mL）處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96 孔板中,待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合狀態(tài)時(shí),按照上述分組,每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔,在37℃、含5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,棄培養(yǎng)液,各孔加入100 μL含10% CCK-8的培養(yǎng)基,繼續(xù)孵育4 h,450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度A。按照式（1）計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.5 A549細(xì)胞內(nèi)蛋白濃度及抗氧化指標(biāo)的測(cè)定

將2 mL（5×104個(gè)/mL）處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種至6 孔板,待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合狀態(tài)時(shí),對(duì)各組進(jìn)行藥物處理。根據(jù)1.3.4節(jié)所得各組的最佳濃度,在37 ℃、含5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,在培養(yǎng)瓶中加入適量冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）,冰浴條件下用細(xì)胞刮收集細(xì)胞,制成細(xì)胞懸液,1 000 r/min離心10 min,棄上清液留細(xì)胞沉淀。用1 mL PBS洗滌細(xì)胞2 次。PBS重懸后,于細(xì)胞破碎儀上30 Hz,10 s破碎。取出離心管,12 000 r/min離心10 min,收集上清液用于后續(xù)檢測(cè)。按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行細(xì)胞蛋白濃度和MDA、GSH含量以及SOD活力測(cè)定。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)A549細(xì)胞內(nèi)ROS相對(duì)含量

按照1∶1 000用無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)液稀釋DCFHDA,使終濃度為10 μmol/L。按1.3.5節(jié)分組將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的A549細(xì)胞接種至6 孔板培養(yǎng)24 h,棄舊細(xì)胞培養(yǎng)液,PBS洗滌,加入1 mL稀釋好的DCFH-DA。37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3 次除去未進(jìn)入細(xì)胞的探針DCFH-DA,0.25%不含EDTA胰酶消化各孔細(xì)胞,輕輕吹打,制成單細(xì)胞懸液,1 000 r/min離心5 min,收集細(xì)胞,500 μL PBS重懸細(xì)胞。200 目濾網(wǎng)過(guò)篩收集細(xì)胞于流式管內(nèi),采用激發(fā)光波長(zhǎng)480 nm,發(fā)射光波長(zhǎng)530 nm,上機(jī)檢測(cè)。Cell Quest Pro軟件測(cè)定ROS平均熒光強(qiáng)度,以其表示ROS相對(duì)含量。

1.3.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

按1.3.5節(jié)分組,將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的A549細(xì)胞接種至6 孔板,于37 ℃、含5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。按照實(shí)驗(yàn)分組用藥處理各組細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,胰酶消化細(xì)胞,含血清培養(yǎng)基終止消化并重懸,1 000 r/min、4 ℃離心10 min,棄上清液；1 mL PBS重懸；離心10 min,棄上清液；重復(fù)洗滌2 次；然后用Annexin V-FITC雙染法測(cè)定A549細(xì)胞凋亡率。

1.3.8 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的相對(duì)表達(dá)量

將1.3.5節(jié)中各藥物組處理的細(xì)胞蛋白上清液,分別按5×上樣緩沖液與蛋白樣品1∶4（V/V）比例混勻煮沸。以每孔50 μg蛋白上樣量對(duì)蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）,轉(zhuǎn)膜,質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉溫室封閉1 h,三羥甲基氨基甲烷-鹽酸-吐溫20緩沖液（Tris buffered saline and tween 20,TBST）洗3 次,分別加入Bcl-2（1∶200）、Bax（1∶200）、Caspase-3（1∶200）及β-actin（1∶500）一抗,4 ℃孵育過(guò)夜；TBST洗3 次,加入對(duì)應(yīng)二抗（1∶10 000）37 ℃孵育1 h,TBST洗3 次,化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光,Quantity One4.4.0軟件測(cè)定蛋白條帶灰度值,并按式（2）計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 DDP對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用

圖1 不同質(zhì)量濃度DDP對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響（n＝3）Fig.1 Effect of different concentrations of DDP on the viability of A549 cells (n = 3)

如圖1所示,用不同質(zhì)量濃度的DDP處理A549細(xì)胞24 h后,細(xì)胞生長(zhǎng)受到不同程度的抑制,隨著DDP質(zhì)量濃度的增加,細(xì)胞存活率逐漸下降,且呈現(xiàn)劑量依賴性。與對(duì)照組相比,各用藥組細(xì)胞存活率具有極顯著差異（P＜0.01）。通過(guò)SPSS軟件計(jì)算,DDP對(duì)細(xì)胞的IC50為11.90 mg/L。

2.2 LBP對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用

如圖2所示,當(dāng)LBP質(zhì)量濃度大于8 mg/L時(shí),對(duì)A549細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用,且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性,提示一定質(zhì)量濃度的LBP可以抑制A549細(xì)胞活力,由SPSS軟件計(jì)算得到LBP對(duì)A549細(xì)胞的IC50為16.27 mg/L。

圖2 不同質(zhì)量濃度LBP對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響（n＝3）Fig.2 Effect of different concentrations of LBP on the viability of A549 cells (n = 3)

2.3 LBP聯(lián)合DDP對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響

對(duì)于后續(xù)的實(shí)驗(yàn),加藥后細(xì)胞存活率太低,后期細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)時(shí),細(xì)胞碎片太多,影響檢測(cè)結(jié)果；細(xì)胞存活率太高,則較難檢測(cè)出細(xì)胞損傷。如表1所示,基于各藥物組對(duì)A549細(xì)胞的半抑制率IC50值,DDP對(duì)A549細(xì)胞的1/2 IC50約為6 mg/L,且LBP質(zhì)量濃度不小于8 mg/L時(shí),A549細(xì)胞存活率為（50.1±5.2）%,最接近50%。因此選用DDP質(zhì)量濃度為6 mg/L,LBP質(zhì)量濃度為8 mg/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 LBP與DDP聯(lián)合作用對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響（n＝3）Table 1 Effect of LBP combined with DDP on the survival rate of A549 cells (n= 3)%

2.4 LBP聯(lián)合DDP對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)抗氧化指標(biāo)的影響

2.4.1 LBP聯(lián)合DDP對(duì)A549細(xì)胞中SOD活力、GSH和MDA含量的影響

圖4 LBP聯(lián)合DDP對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)抗氧化指標(biāo)的影響（n＝3）Fig.4 Effects of LBP combined with DDP on GSH and MDA contents in A549 cells (n = 3)

由圖4可知,與對(duì)照組相比,DDP導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)SOD活力和GSH含量極顯著降低,MDA含量極顯著升高（P＜0.01）；LBP單獨(dú)作用與對(duì)照組比較對(duì)細(xì)胞內(nèi)SOD活力和GSH、MDA含量無(wú)明顯變化。LBP+DDP組SOD活力、GSH和MDA含量與對(duì)照組比較有極顯著差異（P＜0.01）,但與DDP組相比無(wú)顯著性差異。

2.4.2 LBP聯(lián)合DDP對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響

由圖5和表2可知,與對(duì)照組相比,DDP單獨(dú)處理極顯著增加了A549細(xì)胞內(nèi)ROS含量（P＜0.01）,而LBP單獨(dú)處理可極顯著降低A549細(xì)胞內(nèi)ROS含量（P＜0.01）,且LBP和DDP聯(lián)合處理后,細(xì)胞內(nèi)ROS含量與對(duì)照組相比無(wú)顯著性變化。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LBP聯(lián)合DDP對(duì)A549細(xì)胞ROS含量的影響（n＝ 3）Fig.5 Effect of LBP combined with DDP on ROS content in A549 cells (n = 3)

表2 LBP聯(lián)合DDP對(duì)A549細(xì)胞ROS相對(duì)含量的影響（n＝ 3）Table 2 Effect of LBP combined with DDP on ROS content in A549 cells (n= 3)

2.5 LBP聯(lián)合DDP對(duì)A549細(xì)胞凋亡率的影響

用Annexin V-FITC雙染法檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡率,由表3可知,DDP能極顯著增加A549細(xì)胞凋亡率（P＜0.01）,且LBP聯(lián)合DDP處理后,細(xì)胞凋亡率極顯著高于DDP組（P＜0.01）,表明LBP可促進(jìn)DDP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,提示兩者具有聯(lián)合作用。

表3 LBP聯(lián)合DDP對(duì)A549細(xì)胞凋亡率的影響（n ＝3）Table 3 Effect of LBP combined with DDP on the apoptosis rate of A549 cells (n= 3)

2.6 LBP聯(lián)合DDP對(duì)A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖6 LBP聯(lián)合DDP對(duì)A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（n＝ 3）Fig.6 Effect of LBP combined with ciplatin on apoptosis-related protein expression in A549 cells (n = 3)

為了進(jìn)一步探討LBP聯(lián)合DDP對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響,本實(shí)驗(yàn)采用Western blot 檢測(cè)了不同藥物組細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax和活性Caspase-3的相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果如圖6和表4所示,與對(duì)照組相比,DDP和LBP均能極顯著上調(diào)Bax及Bax/Bcl-2,且DDP能極顯著降低Bcl-2的表達(dá)量并上調(diào)活性Caspase-3（P＜0.01）,而LBP單獨(dú)用藥組Bcl-2和活性Caspase-3表達(dá)量與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。LBP和DDP聯(lián)合處理組細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)與對(duì)照組及LBP組均有極顯著性差異（P＜0.01）,與DDP相比,除Bcl-2外,其他蛋白表達(dá)水平均極顯著性升高（P＜0.01）。結(jié)果表明,LBP聯(lián)合DDP可能通過(guò)上調(diào)Bax、活性Caspase-3表達(dá)及Bax/Bcl-2水平來(lái)調(diào)控A549細(xì)胞凋亡。

表4 不同藥物處理組細(xì)胞相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)量（n＝3）Table 4 Relative expression of apoptosis-associated proteins in different drug treatment groups (n= 3)

3 討 論

DDP是目前廣泛采用且效果較好的治療肺癌的化療藥物,DDP的抗癌活性是由環(huán)境中氯離子濃度決定的。在血液及細(xì)胞外組織液中,氯離子濃度高,DDP相對(duì)穩(wěn)定。而當(dāng)其進(jìn)入細(xì)胞液后,氯離子濃度很低,DDP中的兩個(gè)氯離子會(huì)被水所取代,形成水合物。這種水合物很容易與DNA發(fā)生加成反應(yīng),形成交聯(lián),從而使DNA的復(fù)制轉(zhuǎn)錄遭到破壞,細(xì)胞周期停滯,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。由于腫瘤細(xì)胞分裂旺盛,所以腫瘤細(xì)胞較正常細(xì)胞對(duì)DDP造成的DNA 損傷更加敏感,因而,DDP的抗癌活性主要是因?yàn)镈NA加合物的形成[15]。此外,由于細(xì)胞中線粒體本身具有裸露的環(huán)狀DNA,容易突變和受到攻擊,DDP可直接損傷線粒體DNA,造成線粒體損傷；DDP含有的親核氨基也能夠與水分子作用產(chǎn)生大量的自由基,進(jìn)一步造成線粒體的氧化損傷,線粒體損傷和氧化應(yīng)激反應(yīng)相互作用,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[16]。有研究顯示[17]：DDP生物利用度較低,約為10%～35%,按成人常用劑量10～20 mg/d,溶于200 mL生理鹽水中計(jì)算,到達(dá)細(xì)胞時(shí)質(zhì)量濃度為1.05～3.50 mg/L（生物利用度取35%）。本實(shí)驗(yàn)用DDP建立了A549損傷細(xì)胞模型,結(jié)果顯示質(zhì)量濃度為1 mg/L的DDP會(huì)明顯抑制A549細(xì)胞的生長(zhǎng),且呈劑量依賴性,當(dāng)DDP質(zhì)量濃度為6 mg/L時(shí),會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)紊亂,誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。然而,DDP在表現(xiàn)高效抗癌活性的同時(shí),又對(duì)正常組織產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用（如腎毒性、血液毒性和耳毒性等）[18],從而限制了DDP對(duì)腫瘤患者的長(zhǎng)期治療。故尋找高效低毒的腫瘤化療增敏劑以增強(qiáng)DDP的化療效果,改善患者的生活質(zhì)量成為重要課題。

近年來(lái),天然藥物在腫瘤治療過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,目前發(fā)現(xiàn)許多天然藥物提取活性成分如黃芪多糖、靈芝多糖及苦參堿等都具有較好的抗腫瘤作用[19-21]。LBP是從枸杞果實(shí)中提取的活性多糖,研究顯示LBP具有較好的抗腫瘤活性[22]。LBP作為一種具有多種抗腫瘤活性的中藥,可以協(xié)同化療藥物更好地發(fā)揮抗腫瘤作用[23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明一定質(zhì)量濃度LBP（8 mg/L）單獨(dú)用藥對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖有極顯著抑制作用,且呈劑量依賴性,其生物利用度可達(dá)36.01%,按成人健康推薦攝入量1 600 mg/d、治療推薦攝入量2 400 mg/d,到達(dá)細(xì)胞濃度約為12～18 mg/L。LBP聯(lián)合DDP能極顯著降低A549細(xì)胞的存活率,表明LBP能增強(qiáng)DDP對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。

ROS是細(xì)胞在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的含氧活性化合物的總稱,其可以參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多種分子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性。腫瘤細(xì)胞的ROS產(chǎn)生較正常細(xì)胞明顯增多,主要是受腫瘤基因、線粒體功能變異等因素的影響,使細(xì)胞處于一種更高的氧化應(yīng)激狀態(tài)。Finkel等[24]研究結(jié)果表明,少量的ROS可以作為信號(hào)分子介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,參與炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng),對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用；但是一旦過(guò)量就會(huì)引起脂質(zhì)過(guò)氧化,形成過(guò)氧化產(chǎn)物MDA,導(dǎo)致細(xì)胞的DNA損傷或凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DDP單獨(dú)用藥會(huì)降低A549細(xì)胞內(nèi)GSH含量和SOD活力,且細(xì)胞內(nèi)MDA含量和ROS含量均極顯著增加（P＜0.01）。提示DDP引起A549細(xì)胞的氧化應(yīng)激,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。鄭銳年等[25]研究表明ROS通過(guò)上調(diào)ROS-AKT1-JNK信號(hào)誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞株HEPG2細(xì)胞凋亡。正常生理?xiàng)l件下,細(xì)胞內(nèi)的ROS由胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)調(diào)節(jié)保持平衡狀態(tài)[4],而DDP進(jìn)入細(xì)胞后,通過(guò)損傷線粒體呼吸作用電子傳遞鏈,促進(jìn)細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS的積累[26]。在機(jī)體內(nèi),抗氧化系統(tǒng)（SOD、GSH等）能清除多余的ROS維持氧化還原反應(yīng)的平衡。SOD是一種高效氧自由基清除劑,幾乎存在于所有生物細(xì)胞中,SOD通過(guò)與過(guò)氧化物酶和氧化物酶作用催化超氧陰離子自由基（O2-·）轉(zhuǎn)化為無(wú)害的H2O,從而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的。GSH作為體內(nèi)重要的抗氧化劑和自由基清除劑,具有強(qiáng)大的解毒作用。因此,兩者可作為細(xì)胞抗氧化能力的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,LBP聯(lián)合DDP與DDP單獨(dú)作用相比,ROS含量極顯著降低（P＜0.01）,而GSH、MDA含量和SOD活力均無(wú)顯著變化（P＞0.05）。提示DDP能夠抑制細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活力,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化還原水平紊亂,促使脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)增強(qiáng),從而引起細(xì)胞凋亡。另一方面,LBP聯(lián)合DDP對(duì)DDP所致的細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)紊亂無(wú)明顯影響,卻能有效地清除A549細(xì)胞產(chǎn)生的ROS。另外,曲仙智等[27]通過(guò)研究細(xì)胞糖代謝過(guò)程中相關(guān)抗氧化能力與DDP耐藥之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)升高細(xì)胞內(nèi)ROS水平可以增加膽管細(xì)胞癌QBC939和肝細(xì)胞癌HepG2對(duì)DDP的敏感性。且He Guodong等[28]研究發(fā)現(xiàn)ROS抑制劑能夠降低DDP的抗癌活性。本研究中凋亡結(jié)果顯示,A549細(xì)胞在DDP單獨(dú)處理后凋亡率從3.57%升高到了28.36%,兩者聯(lián)用后細(xì)胞凋亡率升高至45.55%,提示LBP能明顯增強(qiáng)DDP對(duì)A549細(xì)胞的促凋亡作用,但此過(guò)程中氧化應(yīng)激反應(yīng)并不是LBP促進(jìn)DDP誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制。

細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡,通常伴有線粒體膜破裂,細(xì)胞色素c從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)[29-30]。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白,通過(guò)改變線粒體膜的通透性,與Caspase家族蛋白在反饋回路系統(tǒng)中發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的功能[31-32]。Bax蛋白具有促凋亡作用,是細(xì)胞凋亡通路的重要組成部分。已有文獻(xiàn)表明,Bcl-2表達(dá)的減少和Bax表達(dá)的增加均會(huì)增加線粒體膜通透性,從而促進(jìn)細(xì)胞色素c等凋亡激活因子的釋放,進(jìn)而增強(qiáng)Caspase-3的活化誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[33]。Koraneekit等[34]研究表明咖啡酸和DDP的聯(lián)合作用可上調(diào)Caspase-3和Bcl-2,進(jìn)而促進(jìn)人宮頸癌細(xì)胞凋亡。Liu Lei等[35]采用單細(xì)胞分析研究了DDP誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中Bax的動(dòng)力學(xué)分布,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明LBP和DDP單獨(dú)用藥組導(dǎo)致A549細(xì)胞內(nèi)Bcl-2表達(dá)量減少,Bax和活性Caspase-3表達(dá)量增加,提示LBP和DDP可通過(guò)促線粒體釋放因子途徑誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。另外,Bax/Bcl-2的比值對(duì)于反映藥物誘導(dǎo)的癌細(xì)胞凋亡至關(guān)重要,其意義優(yōu)于Bcl-2的表達(dá)水平,LBP與DDP聯(lián)合處理A549細(xì)胞后,活性Caspase-3表達(dá)極顯著增加,且Bax/Bcl-2增大,線粒體的滲透性過(guò)渡孔隙打開(kāi),導(dǎo)致細(xì)胞色素c、Caspase-9等促凋亡蛋白流出,促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。提示LBP聯(lián)合DDP促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡與其可以共同上調(diào)Bax、下調(diào)Bcl-2表達(dá)并同時(shí)激活Caspase-3的表達(dá)有關(guān)。

PI3K/Akt信號(hào)通路作為細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一,參與很多重要的生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控,其通過(guò)影響下游多種效應(yīng)分子的活化狀態(tài),在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著抑制凋亡、促進(jìn)增殖的關(guān)鍵作用,與人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[36-37],該信號(hào)通路被認(rèn)為是癌細(xì)胞存活的首要通路。本研究證實(shí)LBP聯(lián)合DDP促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡與其可以共同上調(diào)Bax、下調(diào)Bcl-2表達(dá)并同時(shí)激活Caspase-3的表達(dá)有關(guān),但其對(duì)PI3K/AKt信號(hào)通路、蛋白激酶B信號(hào)作用通道AKt等的影響有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述,LBP對(duì)DDP抑制人肺腺癌細(xì)胞A549生長(zhǎng)有聯(lián)合促進(jìn)作用,且LBP能夠增強(qiáng)DDP誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡,這是由于LBP與DDP聯(lián)合作用可以調(diào)節(jié)A549細(xì)胞內(nèi)促凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),而LBP的抗氧化能力對(duì)DDP的促細(xì)胞凋亡作用并沒(méi)有顯著影響。