喻最新,王日葵,賀明陽,洪 敏,袁小淞,王 晶,馮 雨,吳志剛

（西南大學(xué)柑桔研究所,重慶 400712）

血橙（Citrus sinensisL.Osbeck）屬于甜橙類,滋味濃郁、酸甜可口、肉質(zhì)細(xì)嫩,散發(fā)獨(dú)特的玫瑰香氣[1]。常見的血橙品種主要是‘塔羅科’（Tarocco）、‘摩洛’（Moro）和‘桑吉耐洛’（Sanguinello）,其中我國主要引進(jìn)并廣泛種植的血橙品種為‘塔羅科’[2]。血橙中因含有豐富的抗壞血酸、多酚、類黃酮以及羥基肉桂酸等活性化合物而具有極高的營養(yǎng)價(jià)值,廣受消費(fèi)者的喜愛[3]。血橙是唯一含花色苷的柑橘品種[3],花色苷是一類廣泛存在于植物中的色素,屬于黃酮類化合物[4]?；ㄉ召x予植物豐富多彩的顏色,從而有助于植物授粉、抵抗病蟲害、抵御紫外線損傷[5],同時(shí)還對人體有多種生理保健功能,如預(yù)防肥胖癥、糖尿病[6]、抗炎癥、抗氧化[7]等。

花色苷賦予血橙果肉鮮艷的顏色,血橙果實(shí)中花色苷的含量是血橙商業(yè)價(jià)值的重要評價(jià)指標(biāo)[8]。本實(shí)驗(yàn)研究了血橙成熟過程中（開花后200～324 d）果實(shí)花色苷質(zhì)量濃度、花色苷合成相關(guān)基因的表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化,并通過皮爾遜相關(guān)系數(shù)和多元逐步回歸分析花色苷積累與糖酸含量之間的相關(guān)性,以期為探索血橙花色苷積累規(guī)律提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘塔羅科’血橙采自重慶市璧山區(qū)綠躍血橙種植園,選擇長勢一致的‘塔羅科’血橙樹體,樹齡為30 年。開花時(shí)間為2017年4月23日,采樣日期為2017年11月9日至2018年3月13日。每隔15 d左右采一次樣,每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)15 個(gè)果實(shí)。選擇大小正常、無機(jī)械損傷、無病蟲害的果實(shí),采后當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,每個(gè)果實(shí)取一半用液氮速凍后混合均勻,保存于-80 ℃超低溫冰箱備用,另一半榨汁測定色差以及花色苷質(zhì)量濃度。

KCl（分析純）、CH3COONa（分析純） 重慶川東化工試劑廠；乙腈、甲醇（均為色譜統(tǒng)） 西格瑪奧德里奇（上海）有限公司；葡萄糖、果糖、蔗糖、蘋果酸、檸檬酸、檸檬酸（均為色譜純） 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260 高效液相色譜（high performance liquid chromatography,HPLC）儀 美國安捷倫公司；CFX96實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative polymerase chain reaction,qPCR）儀 美國伯樂公司；TU-1901紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；H1850R臺式高速冷凍離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 總花色苷質(zhì)量濃度分析

參照Crifò等[9]的方法并略作修改。血橙榨汁后10 000 r/min離心10 min,取2 mL上清液用緩沖液A（0.05 mol/L KCl、0.15 mol/L HCl,pH 1.0）稀釋至10 mL,另取2 mL上清液用緩沖液B（0.4 mol/L CH3COONa、0.24 mol/L HCl,pH 4.5）稀釋至10 mL,于510 nm和700 nm波長處測定吸光度。按下式計(jì)算總花色苷質(zhì)量濃度。

式中：A＝（A510nm-A700nm）pH1.0-（A510nm-A700nm）pH4.5；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷在pH 1.0緩沖液中510 nm波長處的摩爾吸光系數(shù)（24 825 L/（mol·cm））；Mw為矢車菊素-3-葡萄糖苷相對分子質(zhì)量（484.82）；DF為稀釋倍數(shù)；L為光程/cm。

1.3.2 可溶性糖含量分析

參照Albertini等[10]的方法并略作修改。準(zhǔn)確稱取1 g血橙果肉于研缽中,加入5 mL超純水研磨成勻漿后倒入15 mL離心管中,用1 mL超純水潤洗研缽后一并移入離心管中,在4 ℃下,15 000 r/min離心10 min,取上清液定容于10 mL容量瓶,過0.22 μm濾膜,濾液即為HPLC供試樣品。

HPLC條件：APS-2 HYPERSIL色譜柱（260 mm×4.6 mm,5 μm）；進(jìn)樣量為10 μL；流動(dòng)相為乙腈和水（體積比70∶30）；流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃；示差折光檢測器。

1.3.3 有機(jī)酸含量分析

1.3.3.1 抗壞血酸含量分析

參照江海等[11]的方法并略作修改。準(zhǔn)確稱取1 g果肉于研缽中,加入5 mL超純水研磨成勻漿后倒入15 mL離心管中,用1 mL超純水刷洗研缽后一并移入離心管中,在4 ℃下,15 000 r/min離心10 min,取上清液定容于10 mL容量瓶,過0.22 μm濾膜備用。

HPLC條件：UMISILC18（2）色譜柱（260 mm×4.6 mm,5 μm）；進(jìn)樣量為10 μL；流動(dòng)相為甲醇和體積分?jǐn)?shù)0.1%磷酸（體積比1∶99）；流速0.8 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長為245 nm。

1.3.3.2 檸檬酸、蘋果酸含量分析

參照李云康[12]的方法并略作修改。準(zhǔn)確稱取1 g血橙果肉于研缽中,加入5 mL 0.05 mol/L的KH2PO4溶液（pH 2.5）研磨成勻漿后倒入15 mL離心管中,在4 ℃下15 000 r/min離心10 min,取上清液用0.05 mol/L KH2PO4溶液定容于10 mL容量瓶,過0.22 μm濾膜備用。

HPLC條件：Venusil MP C18柱（260 mm×4.6 mm,5 μm）；進(jìn)樣量為20 μL；流動(dòng)相為甲醇和0.05 mol/L KH2PO4溶液（體積比97∶3）,0.05 mol/L KH2PO4溶液用磷酸調(diào)pH值至2.5；流速1 mL/min；柱溫40 ℃；檢測波長為210 nm。

1.3.4 RNA提取、cDNA第一鏈的合成及qPCR

1.3.4.1 RNA提取和cDNA第一鏈的合成

嚴(yán)格按照植物多糖多酚總RNA提取試劑盒操作說明書進(jìn)行血橙果肉RNA的提取。以提取的RNA為模板,利用FastKing RT Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。

1.3.4.2 qPCR條件

表1 qPCR引物序列Table 1 Nucleotide sequences of primers used for real-time PCR

內(nèi)參基因選用EF-1α,內(nèi)參基因和CHS基因引物序列參考喻最新等[13]的研究,基因PAL、C4H、4CL、CHI、F3H、F3’5’H、DFR、ANS、UFGT、GST、Ruby的引物參考Carmona等[14]的研究。AI、SS1、SS2、SPS1、SPS2、SPS3、CS、AC、IDH的引物根據(jù)美國國家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI）數(shù)據(jù)庫內(nèi)相應(yīng)EST序列用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)。具體的引物序列見表1。

qPCR使用TB Green? Premix ExTaq? II（Tli RNaseH Plus）試劑盒。在96 孔PCR板上加入如下反應(yīng)體系：TBGreen Premix ExTaqTMII（2×）10 μL,上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL,1.5 μL DNA模板,去離子水補(bǔ)足至20 μL。

使用CFX96TMReal-Time Systerm進(jìn)行qPCR,反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s,58 ℃復(fù)性30 s,經(jīng)過40 個(gè)循環(huán)反應(yīng)。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行65～95 ℃的溶解曲線分析,其中每5 s溫度增加0.5 ℃,以鑒別引物二聚體和非特異性擴(kuò)增。每個(gè)模板做3 次重復(fù)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel軟件結(jié)合SPSS 17.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析,并用Origin 9軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 血橙成熟過程中果肉、果汁顏色及總花色苷質(zhì)量濃度的變化

圖1 血橙成熟過程中果肉、果汁顏色變化Fig.1 Changes in pulp and juice color of blood oranges during the ripening period

由圖1可知,在開花后200～243 d,血橙果肉以及果汁肉眼幾乎看不到紅色,開花后261 d可以看到果肉微弱的紅色,果汁顏色加深。隨著果實(shí)進(jìn)一步成熟,紅色越來越深。至開花后324 d,果肉中可以看到一些紅血絲,果汁呈紅色,但著色并不深。

圖2 血橙成熟過程中總花色苷質(zhì)量濃度的變化Fig.2 Changes in total anthocyanin content of blood oranges juice during the ripening period

由圖2可知,開花后200～243 d血橙果實(shí)中不含花色苷。開花后261 d在血橙果汁中開始檢測到微量花色苷,且質(zhì)量濃度隨著果實(shí)成熟逐漸升高。開花后243～276 d,果汁中的花色苷質(zhì)量濃度從0上升至2.84 mg/L,日均約提高0.09 mg/L；開花后276～293 d,果汁中的花色苷質(zhì)量濃度從2.84 mg/L上升至12.25 mg/L,日均提高約0.55 mg/L；開花后293～324 d,果汁中的花色苷質(zhì)量濃度從12.25 mg/L上升至19.28 mg/L,日均提高約0.23 mg/L。由此可知在整個(gè)成熟過程中,血橙果實(shí)中的花色苷在開花后276～293 d積累的速率最快。花色苷質(zhì)量濃度的變化與果肉、果汁顏色的變化進(jìn)程基本一致。

2.2 血橙成熟過程中花色苷合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因相對表達(dá)量的變化

圖3 血橙花色苷的生物合成途徑[14]Fig.3 Biosynthesis pathway of anthocyanins in blood oranges[14]

血橙花色苷的生物合成途徑已經(jīng)研究得較為成熟[14]：如圖3所示,苯丙氨酸在苯丙氨酸裂解酶（phenylalanine ammonialyase,PAL）、肉桂酸羥化酶（cinnamate 4-hydroxylase,C4H）、4-香豆酰輔酶A連接酶（4-coumarate CoA ligase,4CL）、查耳酮合成酶（chalcone synthase,CHS）、查耳酮異構(gòu)酶（chalcone isomerize,CHI）、黃烷酮-3-羥化酶（flavonone 3-hydroxylase,F3H）、類黃酮-3-羥化酶（flavonoid 3'-hydroxylase,F3'H）和類黃酮-3,5-羥化酶（flavonoid 3'5'-hydroxylase,F3'5'H）的作用下經(jīng)過一系列的反應(yīng)轉(zhuǎn)化為二氫黃酮醇。二氫黃酮醇是類黃酮代謝途徑的一個(gè)重要節(jié)點(diǎn),二氫黃酮醇既可以在黃酮醇合成酶（flavonol synthase,FLS）的作用下生成黃酮醇,又可以在二氫黃酮醇-4-還原酶（dihydroflavonol 4-reductase,DFR）作用下生成無色花青素,無色花青素經(jīng)花青素合成酶（anthocyanin synthase,ANS）、類黃酮-3,5-糖苷轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucose-flavonoid 3-O-glucosyltransferase,UFGT）催化轉(zhuǎn)化為花色苷,花色苷在谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（glutathione-S-transferases,GST）的作用下貯藏至液泡中。PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、F3’5’H、DFR、FLS、ANS、UFGT、GST是血橙花色苷生物合成途徑中的主要結(jié)構(gòu)基因,這些基因的表達(dá)量與血橙中花色苷的積累密切相關(guān),因此了解這些基因在血橙成熟過程中的表達(dá)情況可以從分子水平上初步了解血橙花色苷的積累機(jī)制。

圖4 血橙成熟過程中花色苷合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因相對表達(dá)量的變化Fig.4 Changes in transcription levels of anthocyanin biosynthesis-related structural genes in the pulp of blood oranges during the ripening period

由圖4可知,在血橙成熟過程中,果實(shí)中FLS基因的相對表達(dá)量在開花后200～243 d急劇上升,在開花后261～324 d相對表達(dá)量變化不大,因此推測開花后200～243 d是黃酮醇的迅速積累期。C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、F3’5’H、DFR、ANS、UFGT、GST基因的相對表達(dá)量總體均呈先上升后下降的正態(tài)分布規(guī)律,開花后261～293 d為高效表達(dá)時(shí)期,其中4CL、CHS、F3’5’H、DFR、GST基因相對表達(dá)量的上調(diào)100 倍以上,F3H、ANS、UFGT基因相對表達(dá)量上調(diào)10 倍以上,而PAL、C4H、CHI基因相對表達(dá)量上調(diào)不明顯。開花后261～293 d也是血橙果實(shí)中花色苷開始合成并快速積累的時(shí)期,結(jié)構(gòu)基因高效表達(dá)的時(shí)期與血橙果實(shí)花色苷含量開始合成并快速積累的時(shí)期是一致的,因此可以推測4CL、CHS、F3H、F3’5’H、DFR、ANS、UFGT、GST基因在血橙果實(shí)花色苷合成的過程中起關(guān)鍵作用[14]。

2.3 血橙成熟過程中花色苷合成相關(guān)調(diào)節(jié)基因相對表達(dá)量的變化

Butelli等[15]從血橙中分離得到R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子并命名為Ruby。血橙和普通甜橙中均有Ruby基因,但在普通甜橙中Ruby轉(zhuǎn)錄因子相對表達(dá)量極低。將血橙和‘克里曼丁’雜交,后代果實(shí)中Ruby轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量同果肉中的花色苷含量具有顯著的相關(guān)性。由圖5可知,在血橙果實(shí)成熟的過程中,Ruby轉(zhuǎn)錄因子的相對表達(dá)量呈現(xiàn)出先上升后下降的正態(tài)分布趨勢,其中開花后261～293 d為高效表達(dá)時(shí)期,在開花后293 d達(dá)到表達(dá)高峰,上調(diào)表達(dá)19.57 倍。Ruby轉(zhuǎn)錄因子是影響‘塔羅科’血橙著色的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。

圖5 血橙成熟過程中Ruby轉(zhuǎn)錄因子相對表達(dá)量的變化Fig.5 Changes in transcription levels of Ruby in the pulp of blood oranges during the ripening period

2.4 血橙成熟過程中可溶性糖含量的變化

2.4.1 果糖、葡萄糖、蔗糖含量

圖6 血橙成熟過程中不同種類糖含量的變化Fig.6 Changes in contents of various sugars in the pulp of blood oranges during the ripening period

柑橘中含有的可溶性糖主要是果糖、葡萄糖、蔗糖[16]。由圖6可知,在開花后200～324 d血橙果實(shí)中的果糖含量整體呈持續(xù)上升的趨勢,從13.68 mg/g上升至18.14 mg/g。血橙果實(shí)中果糖的積累速率在果實(shí)成熟前期（開花后200～261 d）較快,日均提高0.049 7 mg/g,后期（開花后261～324 d）積累速率明顯下降,日均提高0.004 7 mg/g。

在開花后200～324 d血橙果實(shí)中的葡萄糖含量呈持續(xù)上升的趨勢,從13.68 mg/g增加至17.66 mg/g,其中在開花后276 d略有下降。與果糖類似,血橙果實(shí)中葡萄糖的積累速率在果實(shí)成熟前期（開花后200～261 d）較快,日均提高0.048 4 mg/g,后期（開花后261～324 d）積累速率顯著下降,日均提高0.016 3 mg/g。

在開花后200～324 d血橙果實(shí)中的蔗糖含量呈波動(dòng)變化的趨勢,在開花后215 d達(dá)到高峰,含量為35.32 mg/g。在開花后200～324 d,果實(shí)中的蔗糖增幅很小,僅增長了1.56 mg/g,遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于果糖和葡萄糖的增幅。

在開花后200～324 d血橙果實(shí)中積累的可溶性糖主要為果糖和葡萄糖,蔗糖含量僅在開花后200～215 d有少量積累,在開花后215～324 d變化很小。王貴元等[17]研究發(fā)現(xiàn)紅肉臍橙果肉中蔗糖主要在果實(shí)著色前積累,而葡萄糖和果糖主要于果實(shí)成熟過程中積累,成熟時(shí)果肉中葡萄糖、果糖和蔗糖含量比約為1∶1∶2,研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一致性。

2.4.2 總糖含量

由圖6可知,血橙果實(shí)中果糖、葡萄糖、蔗糖含量比接近于1∶1∶2,因此蔗糖是影響果實(shí)總糖含量的主要因素。由圖7可知,在開花后261～324 d血橙果實(shí)中的總糖含量基本呈波動(dòng)上升的趨勢,從57.92 mg/g上升至68.36 mg/g,日均提高0.084 2 mg/g。

圖7 血橙成熟過程中總糖含量的變化Fig.7 Changes in total sugar content in the pulp of blood oranges during the ripening period

2.5 血橙成熟過程中糖代謝相關(guān)酶基因表達(dá)量的變化

圖8 血橙成熟過程中蔗糖代謝相關(guān)酶基因相對表達(dá)量的變化Fig.8 Changes in transcription levels of sucrose metabolism-related genes in the pulp of blood oranges during the ripening period

與柑橘糖代謝相關(guān)的基因主要有酸性轉(zhuǎn)移酶（acid invertase,AI）基因、蔗糖合成酶（sucrose synthase,SS）基因以及蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate,SPS）基因[16]。由圖8可知,在血橙成熟過程中,AI、SS1、SS2（蔗糖合成酶兩個(gè)異構(gòu)形式的基因）、SPS1、SPS2、SPS3（蔗糖磷酸合成酶基因3 個(gè)異構(gòu)形式的基因）的表達(dá)量均呈波動(dòng)變化。酸性轉(zhuǎn)化酶催化蔗糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖和果糖,一般來說,AI基因表達(dá)量越高,蔗糖積累量越低[18]。但在本實(shí)驗(yàn)中并沒有出現(xiàn)這樣的現(xiàn)象,推測血橙果實(shí)中AI基因的表達(dá)量對果實(shí)糖分積累的調(diào)控作用比較小。蔗糖合成酶既可以分解蔗糖,又可以合成蔗糖[18]。SS1、SS2基因在大部分時(shí)間均上調(diào)表達(dá),由此推測果實(shí)中的蔗糖處于不斷被分解、合成的動(dòng)態(tài)變化之中,造成了蔗糖含量的持續(xù)波動(dòng)。血橙成熟過程中,SPS1基因在大部分時(shí)間下調(diào)表達(dá),SPS2、SPS3基因在大部分時(shí)間均上調(diào)表達(dá),因此推測,SPS2、SPS3基因在調(diào)控‘塔羅科’血橙糖分積累中具有重要作用。

2.6 血橙成熟過程中有機(jī)酸含量的變化

2.6.1 抗壞血酸、蘋果酸、檸檬酸含量

由圖9可知,血橙果實(shí)中的抗壞血酸含量在開花后200～215 d由0.72 mg/g上升到0.87 mg/g,隨后波動(dòng)下降,至開花后324 d,血橙果實(shí)中的抗壞血酸含量為0.61 mg/g。血橙果實(shí)中的蘋果酸含量在開花后200～276 d持續(xù)下降,開花后276～309 d出現(xiàn)上升的趨勢,接著繼續(xù)下降。至開花后324 d,血橙果實(shí)中的蘋果酸含量為0.43 mg/g。在開花后200～276 d,血橙果實(shí)中的檸檬酸含量緩慢下降,在開花后276～309 d檸檬酸含量出現(xiàn)上升的趨勢,在開花后309～324 d開始急劇下降,由11.37 mg/g下降到6.52 mg/g。

圖9 血橙成熟過程中不同種類有機(jī)酸含量的變化Fig.9 Changes in contents of various organic acids in the pulp of blood oranges during the ripening period

有機(jī)酸在果實(shí)發(fā)育過程中的一般規(guī)律為：在果實(shí)發(fā)育前期迅速積累升高,后期持續(xù)降低。果實(shí)成熟后期有機(jī)酸含量下降有很多原因,如果實(shí)體積增加、水分大量進(jìn)入、有機(jī)酸的分解速率大于合成速率、有機(jī)酸作為基質(zhì)參與呼吸和糖異生作用等[19]。但在開花后276～309 d,血橙果實(shí)中的檸檬酸和蘋果酸含量均出現(xiàn)了升高的趨勢,可見果實(shí)中有機(jī)酸的積累是一個(gè)復(fù)雜的過程,其含量受到有機(jī)酸合成、降解、貯藏、利用等多個(gè)方面的影響[20]。

2.6.2 總酸含量

血橙果實(shí)中的有機(jī)酸主要是檸檬酸,相對含量達(dá)到80%以上,總酸的變化曲線與檸檬酸的變化曲線基本一致。如圖10所示,在開花后200～276 d,總酸含量緩慢下降,在開花后276～309 d出現(xiàn)了短暫上升的現(xiàn)象,在開花后309～324 d,果實(shí)中的總酸含量急劇下降。

圖10 血橙成熟過程中總酸含量的變化Fig.10 Changes in total acid content in the pulp of blood oranges during the ripening period

2.7 血橙成熟過程中有機(jī)酸代謝相關(guān)酶基因表達(dá)量的變化

圖11 血橙成熟過程中有機(jī)酸代謝相關(guān)酶基因相對表達(dá)量的變化Fig.11 Changes in transcription levels of citric acid metabolismrelated genes in the pulp of blood oranges during the ripening period

與柑橘有機(jī)酸代謝相關(guān)的基因主要是線粒體檸檬酸合成酶（citrate synthase,CS）基因、質(zhì)體順烏頭酸酶（aconitase,AC）基因以及質(zhì)體異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase,IDH）基因。線粒體檸檬酸合成酶催化草酰乙酸和乙酰輔酶A合成檸檬酸,質(zhì)體順烏頭酸酶催化檸檬酸轉(zhuǎn)變?yōu)楫悪幟仕?在質(zhì)體異檸檬酸脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)棣?酮戊二酸[21]。由圖11可知,在果實(shí)成熟過程中,CS基因和AC基因相對表達(dá)量呈先升高后降低的正態(tài)分布規(guī)律,IDH基因相對表達(dá)量呈波動(dòng)變化。同時(shí),CS、AD、IDH基因在血橙果實(shí)成熟過程中均上調(diào)表達(dá),由此推測果實(shí)中的檸檬酸一直在合成,同時(shí)不斷被分解。在開花后309～324 d,果實(shí)中的CS基因和AC基因相對表達(dá)量均下降,但I(xiàn)DH基因相對表達(dá)量上升,造成果實(shí)中檸檬酸合成的速率較慢,但分解的速率比較快,引起檸檬酸含量的急劇下降。

2.8 血橙成熟過程中花色苷與可溶性糖、有機(jī)酸含量的相關(guān)性分析結(jié)果

糖是合成花色苷的原料,不僅可以通過糖酵解途徑影響花色苷代謝,還作為信號分子[22],通過己糖激酶、Ca2+/鈣調(diào)蛋白（calmodulin,CaM）、蛋白激酶/蛋白磷酸酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控花色苷合成相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控花色苷的積累[23-24]。己糖激酶能夠感知細(xì)胞間的糖信號引發(fā)糖信號傳遞[23]。Neta-Sharir等[24]研究發(fā)現(xiàn)糖作為信號分子通過己糖激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控花色苷的生物合成。甘露糖和D-2-脫氧葡萄糖均能被己糖激酶磷酸化,甘露糖、D-2-脫氧葡萄糖、果糖、葡萄糖、蔗糖均能夠有效促進(jìn)矮牽?；ǚe累花色苷。而3-O-甲基葡萄糖不能被己糖激酶磷酸化,研究發(fā)現(xiàn)它不具有調(diào)控花色苷合成的效果[23]。甘露庚酮糖是一種己糖激酶的抑制劑,它可以與己糖激酶競爭性結(jié)合從而抑制葡萄糖的磷酸化。研究發(fā)現(xiàn)甘露庚酮糖可以完全消除蔗糖[23]、葡萄糖[24]對花色苷合成的促進(jìn)作用。植物中的Ca2+在很多生理和代謝活動(dòng)中作為信號分子,Ca2+與它在細(xì)胞內(nèi)的感受器CaM結(jié)合能夠調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育,具有廣泛的生物學(xué)功能[23]。維拉帕米和LaCl3都是鈣通道阻滯劑,乙二醇-雙-(2-氨基乙基)四乙酸是一種Ca2+螯合劑,三者均可以消除蔗糖對花色苷積累的誘導(dǎo)作用,而外源添加Ca2+可部分恢復(fù)蔗糖對花色苷積累的誘導(dǎo)作用,使用鈣調(diào)蛋白拮抗劑W7和氯丙嗪處理同樣會削弱蔗糖對花色苷積累的誘導(dǎo)作用。鈣調(diào)蛋白也參與糖對花色苷調(diào)控的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[23]。蛋白質(zhì)磷酸化是細(xì)胞之間信號傳遞的重要途徑,蛋白激酶和蛋白磷酸酶活性的平衡決定了蛋白質(zhì)磷酸化的水平[25]。研究證實(shí)蛋白激酶抑制劑和蛋白磷酸酶抑制劑都可以削弱蔗糖對花色苷積累的調(diào)控[23]。由表2可知,血橙在成熟過程中果實(shí)中的花色苷質(zhì)量濃度與果糖、葡萄糖含量正相關(guān)性極顯著,相關(guān)系數(shù)分別為0.810和0.799,但與蔗糖、總糖的相關(guān)性不顯著。由此推測,成熟過程中血橙果實(shí)中果糖、葡萄糖的快速積累可能是促進(jìn)花色苷合成以及果實(shí)著色的重要原因。Weiss等[26]報(bào)道高等植物中糖的積累是促進(jìn)花瓣著色的重要原因,本研究的結(jié)果與其報(bào)道具有一致性。

迄今為止,植物中有機(jī)酸和花色苷相關(guān)性的報(bào)道不是很多,很多研究都是關(guān)于pH值對花色苷穩(wěn)定性的影響方面,有機(jī)酸可以改變液泡的酸堿環(huán)境從而影響花色苷的呈色以及穩(wěn)定性；同時(shí),花色苷合成相關(guān)酶均需要在一個(gè)合適的pH值范圍內(nèi)才能很好地發(fā)揮催化功能[27]。由表2可知花色苷質(zhì)量濃度與抗壞血酸含量呈顯著負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)-0.715,與蘋果酸含量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為-0.798,與檸檬酸和總酸呈負(fù)相關(guān),但相關(guān)性不顯著。這一研究結(jié)果與Liu Yulian等[28]的報(bào)道具有一致性,果實(shí)中的有機(jī)酸可以通過取代花色苷的糖苷配基從而影響花色苷的呈色,降低花色苷的含量。因此推測有機(jī)酸尤其是抗壞血酸、蘋果酸含量的下降可能也是促進(jìn)果實(shí)花色苷含量上升的原因。但血橙中含有的抗壞血酸與蘋果酸都是微量的,成熟過程中血橙果實(shí)中抗壞血酸與蘋果酸含量的下降與花色苷的積累是否存在直接的關(guān)聯(lián)還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

3 結(jié) 論

在‘塔羅科’血橙成熟過程中（開花后200～324 d）,果實(shí)中的花色苷質(zhì)量濃度呈逐漸上升的趨勢。在開花后261 d開始在血橙汁中檢測到花色苷,開花后276～293 d是血橙果實(shí)花色苷的快速積累時(shí)期,在此期間血橙汁中的花色苷質(zhì)量濃度日均提高0.55 mg/L。至開花后324 d,血橙汁中的花色苷質(zhì)量濃度為19.28 mg/L。4CL、CHS、F3H、F3’5’H、DFR、ANS、UFGT、GST基因是調(diào)控血橙果實(shí)花色苷積累的核心結(jié)構(gòu)基因,Ruby轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)控血橙果實(shí)花色苷合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。血橙成熟過程中,花色苷質(zhì)量濃度與果糖、葡萄糖含量達(dá)到極顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.810和0.799。成熟過程中血橙果實(shí)中果糖、葡萄糖的積累可能是促進(jìn)花色苷積累的重要原因。血橙成熟過程中花色苷含量與抗壞血酸含量呈顯著負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)為-0.715,與蘋果酸含量呈極顯著負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)為-0.798。血橙成熟過程中抗壞血酸、蘋果酸含量的下降可能也會促進(jìn)血橙果實(shí)中花色苷的積累。但血橙果實(shí)中抗壞血酸與蘋果酸的含量都很少,成熟過程中血橙果實(shí)中抗壞血酸與蘋果酸含量的下降與花色苷的積累是否具有因果關(guān)系還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。