韓興曼,樊金玲,王 攀,朱文學(xué),任國艷

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,河南 洛陽 471023）

姜黃素（curcumin,CCM）具有多種生理和藥理活性,如抗氧化、抗腫瘤、抗人類免疫缺陷病毒作用、抗纖維化作用等,同時也是國內(nèi)外廣泛使用的天然食用色素[1]。CCM的耐熱性好、安全性高[2],但CCM的水溶性很低（11 ng/mL、25 ℃）[3],紫外穩(wěn)定性差[4],中性及堿性條件下易降解[5],跨膜轉(zhuǎn)運率低[6]。這些缺陷不僅影響CCM生物活性的充分發(fā)揮,而且極大程度上限制了其在食品、保健品等領(lǐng)域的應(yīng)用。

植物糖原（phytoglycogen,PG）是由α-1,4和α-1,6-糖苷鍵連接的、高度支化的可溶性α-D-葡聚糖,是一種具有“外緊內(nèi)松”球型結(jié)構(gòu)的天然納米粒[7-8]。PG分子表面和內(nèi)部存在大量的葡萄糖殘基,可參與形成氫鍵,因此PG易溶于冷水或與其他物質(zhì)相互作用。PG球型納米粒的分子分散密度沿半徑方向呈梯度變化,即由外至內(nèi)的分子分散密度由大到小,這使得PG分子內(nèi)部形成相對疏水的環(huán)境,有利于PG與極性較小的物質(zhì)發(fā)生相互作用。

本課題組采用PG負(fù)載CCM,制備PG-CCM復(fù)合物,使CCM的表觀溶解度提高了約2 700 倍；PG-CCM中CCM以無定形非晶體結(jié)構(gòu)存在,氫鍵和疏水相互作用是二者結(jié)合的主要作用力[9]?；谏鲜龀晒?本實驗著重考查了PG負(fù)載后CCM的紫外穩(wěn)定性以及在不同pH值條件下的穩(wěn)定性；同時,采用總還原力測定等方法研究了PG-CCM的抗氧化活性,采用噻唑藍(lán)（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT）法檢測了PG-CCM對MCF-7和A549癌細(xì)胞的抑制活性。結(jié)合PG-CCM復(fù)合物中CCM的存在狀態(tài)、PG與CCM相互作用力以及CCM的分布特征,探討了負(fù)載前后以及不同復(fù)合物樣品中CCM穩(wěn)定性和生物活性變化的可能機(jī)制,PG負(fù)載對于改善CCM的穩(wěn)定性和提高生物利用率具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

加強(qiáng)型甜玉米‘中甜8號’ 北京金農(nóng)科種子科技有限公司。

C1386 CCM 美國Sigma公司；2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS） 上海藍(lán)季生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基 美國HyClone公司；胎牛血清 江蘇恩莫阿賽科技有限公司；胰消化酶 合肥Biosharp科技有限公司；A549細(xì)胞 國家實驗細(xì)胞資源共享服務(wù)平臺（北京總部）；MCF-7細(xì)胞ATCC細(xì)胞庫；其他試劑均為分析純,購自天津市德恩化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

L5S紫外-可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；H2050高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；Nano-ZS90型動態(tài)光散射激光粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司；紫外燈（253.7 nm） 江陰市飛揚(yáng)器械有限公司；E191IR恒溫培養(yǎng)箱 美國西蒙公司；CKX41SF倒置電子顯微鏡 日本OLYMPUS公司；SWCJ-2FD雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；RS-232C酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 PG提取

提取方法參照Bi Lin等[10]報道并作適當(dāng)修改。取‘中甜8號’玉米樣品,經(jīng)粉碎、冷水浸提后,調(diào)節(jié)pH值至4.8沉淀蛋白；離心收集上清液,4 ℃冰箱中靜置沉淀淀粉；離心收集上清液,調(diào)節(jié)pH值至7,高溫（121 ℃、20 min）處理。離心取上清液,加入3 倍體積乙醇沉淀PG,抽濾得到PG固體粉末。采用3,5-二硝基水楊酸法[11]測得PG中的還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.71%,采用考馬斯亮藍(lán)法[12]測得PG中的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.12%。

1.3.2 PG負(fù)載CCM和負(fù)載特征分析

負(fù)載方法：分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、3%和5%的PG水溶液和4 mg/mL CCM乙醇溶液。取4.95 mL各質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PG溶液,加入0.05 mL的CCM溶液,于搖床中振蕩平衡（200 r/min、30 min）；離心（10 000×g、15 min）,棄去未溶的CCM沉淀,上清液即為PG-CCM復(fù)合物溶液。將部分上述溶液凍干成粉,于4 ℃冰箱中保存、備用。復(fù)合物因PG質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同,分別記為1% PG-CCM、3% PG-CCM和5% PG-CCM。

負(fù)載能力分析：取PG-CCM復(fù)合物溶液1 mL,加入4 mL無水乙醇,離心（10 000×g、15 min）。收集上清液,采用分光光度法測定并計算CCM質(zhì)量,檢測波長為425 nm。按式（1）計算負(fù)載能力。

CCM分布特征分析：參照Ofokansi等[13]的方法并作適當(dāng)修改。精確稱取一定量不同種類的PG-CCM復(fù)合物,分別溶于去離子水中,使CCM質(zhì)量濃度為20 μg/mL。每種樣品取1 mL于離心管中,各兩支。搖床振蕩20 min（37 ℃、200 r/min）；一個樣品采用分光光度法測定樣液中CCM質(zhì)量濃度,記為ρA/（μg/mL）；另一個經(jīng)離心（10 000×g、15 min）后用來測定上清液中CCM質(zhì)量濃度,記為ρB/（μg/mL）。按式（2）計算CCM負(fù)載于PG-CCM納米粒表面的比例。

1.3.3 PG-CCM復(fù)合物納米粒的粒徑及表面電位測定

取1.3.2節(jié)中所得的PG-CCM復(fù)合物溶液,分別用蒸餾水稀釋,使PG終質(zhì)量濃度均為2 mg/mL；漩渦振蕩混勻,采用Nano-ZS90型動態(tài)光散射激光粒度儀測定平均粒徑、聚合物分散性指數(shù)（polymer dispersity index,PDI）和表面電位[8]。

1.3.4 PG-CCM復(fù)合物的穩(wěn)定性分析

穩(wěn)定性實驗中,以PG/CCM物理混合物和CCM作為對照,PG/CCM物理混合物制備：將一定量的PG粉末和CCM混合均勻,使二者的質(zhì)量比分別與1% PG-CCM、5% PG-CCM復(fù)合物相等,即得PG/CCM物理混合物。取一定量4 mg/mL CCM乙醇溶液加入去離子水,充分振蕩,即得CCM在水中的分散液。實驗期間每間隔一定時間取出一組樣品,測定CCM質(zhì)量濃度,計算保留率。

1.3.4.1 紫外穩(wěn)定性測定

1）加速光解條件下的紫外穩(wěn)定性：精確稱取樣品,平鋪于25 mL燒杯底面,將燒杯置于紫外燈（30 W）下25 cm處照射。各復(fù)合物和相應(yīng)物理混合物樣品中CCM初始質(zhì)量均為20 μg,CCM樣品取5 μL 4 mg/mL CCM乙醇溶液于燒杯中,置于通風(fēng)櫥將乙醇揮干。分別在1、3、5、7、9、12 h各取一組測定CCM保留率,同時比較復(fù)合物和相應(yīng)物理混合物在5 h時的紫外穩(wěn)定性。2）貯藏條件下的紫外穩(wěn)定性：精確稱取樣品,分別置于4 ℃避光、室溫避光和室溫不避光的環(huán)境中貯藏。PG-CCM復(fù)合物樣品中CCM初始質(zhì)量均為20 μg。120 d后測定CCM保留率。

1.3.4.2 酸堿穩(wěn)定性測定

1）貯藏條件下的酸堿穩(wěn)定性：5% PG-CCM復(fù)合物分別溶于pH 3.0～6.6的磷酸鹽緩沖液中,置于4 ℃冰箱中。CCM初始質(zhì)量濃度均為20 μg/mL。第10天和第20天各取一組樣品測定CCM保留率。2）在體外模擬胃、腸液條件下的穩(wěn)定性：按照Maltais等[14]所述方法分別配制不含消化酶的模擬胃液（pH 1.2）和腸液（pH 6.9、7.2）。將5% PG-CCM復(fù)合物分別溶于模擬胃、腸液中,同時將CCM和不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PG-CCM復(fù)合物分別溶于腸液（pH 7.2）中,CCM初始質(zhì)量濃度均為20 μg/mL,37 ℃水浴。第1、2、4、6、8、10、12小時各取一組樣品測定CCM保留率。

1.3.4.3 CCM質(zhì)量濃度及保留率的測定

1）CCM質(zhì)量濃度的測定：標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：采用紫外分光光度法繪制CCM標(biāo)準(zhǔn)曲線,CCM質(zhì)量濃度在0～7 μg/mL的范圍內(nèi),CCM質(zhì)量濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系,線性回歸方程為y＝0.172 1x+0.013 7（R2＝0.999 7）。固體PG-CCM復(fù)合物和PG/CCM物理混合物樣品CCM質(zhì)量濃度測定：加入1 mL去離子水使之充分溶解,加無水乙醇4 mL混勻后離心（10 000×g、15 min）,取上清液,測其在425 nm波長處的吸光度,計算CCM質(zhì)量濃度。液體PG-CCM復(fù)合物樣品CCM質(zhì)量濃度測定：1 mL液體樣品,加入4 mL無水乙醇,按同樣方法測定吸光度并計算CCM質(zhì)量濃度。固體CCM質(zhì)量濃度測定：加入5 mL 80%乙醇,測定其吸光度并計算CCM質(zhì)量濃度。液體CCM質(zhì)量濃度測定：1 mL液體樣品,加入4 mL無水乙醇,測定其吸光度并計算CCM質(zhì)量濃度。

2）CCM保留率的測定及計算：不同時間點分別取出一組樣品,測定該時刻CCM質(zhì)量濃度,按式（3）計算CCM保留率。

1.3.5 PG-CCM復(fù)合物中CCM的釋放分析

參照Xie Xiaoxia等[15]的方法并略作修改。按1.3.4.2節(jié)配制模擬胃、腸液。稱取1%、5% PG-CCM凍干粉分別加入至模擬胃、腸液中,使CCM質(zhì)量濃度為20 μg/mL。取1 mL于離心管中37 ℃水浴,每隔一定時間取出一組樣品,離心（10 000×g、15 min）后,按1.3.4.3節(jié)所述方法測定上清液中CCM的質(zhì)量濃度；按式（4）計算CCM在模擬胃、腸液中的釋放率。

式中：ρA為0時刻樣液中CCM的質(zhì)量濃度/（μg/mL）；ρB為t時刻經(jīng)離心處理后上清液中CCM的質(zhì)量濃度/（μg/mL）。

1.3.6 PG-CCM復(fù)合物的抗氧化活性分析

樣品準(zhǔn)備：分別配制CCM水分散液（按1.3.4節(jié)所述方法）、CCM乙醇溶液和PG-CCM水溶液3 組樣品,并分別以去離子水、乙醇和相應(yīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PG溶液為對照。

1.3.6.1 總還原力測定

總還原力檢測參考Fan Jinling等[16]的方法并作適當(dāng)修改：取0.5 mL樣液,CCM質(zhì)量濃度為0～70 μg/mL,加入1.5 mL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鐵氰化鉀溶液,水?。?0 ℃、20 min）,取出冷卻后,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸溶液2.5 mL。取混合液2.5 mL,依次加入去離子水2.5 mL和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL,充分混勻,靜置10 min后,在700 nm波長處測定其吸光度?？傔€原力以樣品吸光度與相應(yīng)對照吸光度的差值表示。

1.3.6.2 ABTS陽離子自由基的清除活性測定

ABTS陽離子自由基的清除活性測定參考Li Gao等[17]的方法并作適當(dāng)修改：將ABTS（7 mmol/L）和高硫酸鉀（2.45 mmol/L）等體積混合均勻,室溫避光靜置14 h,生成ABTS工作液；用磷酸緩沖液（0.05 mol/L,pH 7.4）稀釋至吸光度為0.70±0.02（734 nm）。取0.2 mL樣品溶液于試管中,CCM質(zhì)量濃度為0～30 μg/mL,加入3.8 mL ABTS工作液,漩渦混勻后,室溫反應(yīng)30 min,于734 nm波長處檢測吸光度A樣品。CCM水分散液和CCM乙醇溶液樣品的空白對照分別為水和乙醇,PG-CCM樣品的空白對照為對應(yīng)質(zhì)量濃度的PG溶液,測得吸光度為A空白。ABTS陽離子自由基的清除率按式（5）計算。

1.3.7 PG-CCM復(fù)合物對癌細(xì)胞抑制作用率測定

樣品準(zhǔn)備：將CCM分散至DMEM培養(yǎng)基中配制CCM懸濁液,記為CCM/H2O組；將CCM溶于二甲基亞砜（dimethylsulfoxide,DMSO）中配制1 mg/mL母液,用DMEM培養(yǎng)基稀釋得到不同質(zhì)量濃度樣品（DMSO質(zhì)量分?jǐn)?shù)控制在1%）,記為CCM/DMSO組；將PG-CCM復(fù)合物凍干粉復(fù)溶于DMEM培養(yǎng)基中配制不同質(zhì)量濃度PG-CCM樣品液,記為PG-CCM組；上述3 組樣品濃度以CCM計,均為0～150 μmol/L。同時,將PG溶于DMEM培養(yǎng)基配制與PG-CCM組相同PG質(zhì)量濃度的樣品,記為PG組。

MCF-7細(xì)胞和A549細(xì)胞增殖的抑制作用：采用MTT法研究樣品對MCF-7細(xì)胞和A549細(xì)胞增殖的抑制作用。MCF-7和A549細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/mL雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),在37 ℃、含5% CO2氣體的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿瓶底面積的80%；用胰酶消化后,以1×105個/mL濃度接種至96 孔板,每孔200 μL,培養(yǎng)6 h。棄去舊培養(yǎng)基,加入200 μL新鮮培養(yǎng)基或樣品液,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄去舊培養(yǎng)基,磷酸鹽緩沖液清洗兩次,每孔加入200 μL新鮮培養(yǎng)基和10 μL MTT（5 mg/mL）,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。倒掉培養(yǎng)基中液體,吸掉泡沫,加150 μL DMSO反應(yīng)10 min,酶標(biāo)儀測定550 nm波長處樣品孔吸光度,加MTT的樣品孔吸光度記為A2,加等體積培養(yǎng)基的孔吸光度記為A1,不加MTT的孔為記A0,根據(jù)式（6）計算抑制率。PG-CCM組抑制率為扣除PG組抑制率之后的數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

1.3.7 節(jié)實驗重復(fù)6 次,其余所有實驗重復(fù)3 次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；通過DPS軟件采用單因素方差分析法比較各組結(jié)果間的差異顯著性；用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PG-CCM復(fù)合物納米粒的粒徑、表面電位、負(fù)載能力和負(fù)載分布

PG的平均粒徑約為71 nm,PDI小于0.2,呈電中性。以不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PG負(fù)載CCM,得到1% PG-CCM、3% PG-CCM和5% PG-CCM 3 種復(fù)合物。3 種復(fù)合物的平均粒徑、PDI及表面電位與PG相比無顯著變化,彼此之間也無顯著差異。但是,伴隨載體PG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大,負(fù)載能力及負(fù)載于納米粒表面的CCM比例均顯著下降,當(dāng)PG質(zhì)量分?jǐn)?shù)由1%提高到5%時,負(fù)載能力由1.887 μg/mg下降為原來的32%,而納米粒表面的負(fù)載比例則由37.5%減小到17.3%（表1）。

PG是一種天然存在的納米粒[18],具有“外緊內(nèi)松”的球型結(jié)構(gòu),即由內(nèi)至外,分子分散密度由小至大,這使得其分子內(nèi)部形成相對疏水的環(huán)境[7]。將CCM分散于PG的水溶液時,CCM由極性較大的微環(huán)境向PG的疏水區(qū)域轉(zhuǎn)移[9],優(yōu)先分布在PG的疏水內(nèi)核中。載體PG質(zhì)量分?jǐn)?shù)較大,意味著提供了較多的內(nèi)核空間,分布在內(nèi)核的CCM比例高于PG質(zhì)量分?jǐn)?shù)較小載體。

上述研究結(jié)果表明,PG-CCM復(fù)合物是一種粒徑分布均勻、呈電中性的納米粒,CCM在納米粒中的分布因載體質(zhì)量分?jǐn)?shù)而異。CCM在球形納米粒載體PG中的分布特征會影響其穩(wěn)定性、釋放特性及生物活性。

表1 PG-CCM復(fù)合物的粒徑、表面電位、負(fù)載能力和負(fù)載分布Table 1 Average particle size, surface potential, loading capacity and loading distribution of PG-CCM complex

2.2 PG-CCM復(fù)合物的穩(wěn)定性

2.2.1 PG-CCM復(fù)合物的紫外穩(wěn)定性

CCM光敏性很強(qiáng),主要降解產(chǎn)物為香草醛、香草酸和阿魏酸[19]等。Li等[1]報道了CCM暴露于紫外燈光下12 h后的損失率為50%。紫外線照射是一種最常見、有效且簡單的滅菌方法；而貯藏過程中自然光條件下樣品的穩(wěn)定性則直接影響其貨架期。紫外穩(wěn)定性是CCM應(yīng)用于食品等領(lǐng)域時需考慮的問題之一。

2.2.1.1 加速光解條件下的紫外穩(wěn)定性

圖1 紫外光照射條件下PG-CCM復(fù)合物中CCM的穩(wěn)定性Fig.1 Stability of encapsulated CCM in PG-CCM complex under UV irradiation

如圖1所示,CCM表現(xiàn)出顯著的光解不穩(wěn)定性；與CCM相比,3 種PG-CCM復(fù)合物中CCM的降解速率均顯著降低,保留率依次為：5% PG-CCM＞3% PG-CCM＞1% PG-CCM。為了探究復(fù)合物對CCM保護(hù)作用可能機(jī)制,實驗進(jìn)一步比較了PG-CCM復(fù)合物和相應(yīng)物理混合物（PG/CCM）的紫外穩(wěn)定性,從表2可看出,PG/CCM物理混合物中CCM保留率均顯著高于相應(yīng)的PG-CCM復(fù)合物。5 h時,CCM的保留率為24.90%,5% PG-CCM、1% PG-CCM復(fù)合物中CCM的保留率分別提高至79.42%和59.39%,而兩種PG/CCM物理混合物CCM幾乎不損失。

表2 紫外光照射條件下PG-CCM復(fù)合物、PG/CCM物理混合物中CCM穩(wěn)定性的比較Table 2 Comparison of CCM stability in PG-CCM and PG/CCM physical mixtures under UV irradiation

2.2.1.2 貯藏期間的紫外穩(wěn)定性

貯藏溫度和避光處理對不同PG-CCM復(fù)合物樣品中CCM保留率的影響見表3。貯藏溫度對所有PG-CCM復(fù)合物中CCM的保留率均無顯著影響,但避光處理顯著提高了所有PG-CCM復(fù)合物中CCM的保留率。在避光條件下,不同PG-CCM復(fù)合物的穩(wěn)定性均較高,彼此無顯著差異；在不避光條件下,不同PG-CCM復(fù)合物的穩(wěn)定性差異顯著,其保留率依次為5% PG-CCM（65.53%）＞3% PG-CCM（48.79%）＞1% PG-CCM（29.28%）,與加速光解條件下的紫外穩(wěn)定性研究結(jié)果相吻合。

表3 PG-CCM復(fù)合物在不同貯藏條件下的保留率（120 d）Table 3 Retention rates of PG-CCM complex under different storage conditions (after 120 d)%

CCM被負(fù)載或包埋后,其紫外穩(wěn)定性的變化屢有報道,但結(jié)果不一,其原因也未得到很好的解釋。Li Jinglei等[2]用將CCM分散在Eudragit EPO聚合物中,制備得到Cur@EPO,CCM的紫外穩(wěn)定性得到顯著提高。Onoue等[20]利用乙酸琥珀酸羥丙基甲基纖維素制備了非晶固體分散體（ASD-Cur）,其紫外穩(wěn)定性顯著下降。通常情況下,晶體狀態(tài)下物質(zhì)的穩(wěn)定性優(yōu)于無定形狀態(tài)[20]。另一方面,CCM酚羥基氧原子的未成鍵電子,如果作為電子供體提供給自身分子的苯環(huán),則CCM分子較穩(wěn)定；相反,如果參與分子間氫鍵形成,CCM分子的穩(wěn)定性就會被破壞[21]。本課題組前期研究表明：PG-CCM復(fù)合物中,CCM與PG通過分子間氫鍵相互作用,且由晶體狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o定形狀態(tài)[9]。本研究中,CCM的紫外穩(wěn)定性可因載體PG的物理覆蓋效應(yīng)得到顯著提高。但是,由于復(fù)合物中CCM的無定形狀態(tài)以及CCM與PG之間的氫鍵作用,使得PG對CCM的保護(hù)作用在一定程度上被削弱。

不同PG-CCM復(fù)合物的紫外穩(wěn)定性存在較大差異,這可能與CCM在載體PG中的分布不同有關(guān)。如上所述,載體質(zhì)量分?jǐn)?shù)越大,CCM分布于載體表面的比例越小,更多的CCM分布在納米粒的內(nèi)核中,從而提高了對CCM的保護(hù)作用。因此,本研究中5% PG-CCM的紫外穩(wěn)定性優(yōu)于1%～3% PG-CCM。

2.2.2 PG-CCM復(fù)合物的酸堿穩(wěn)定性

CCM在pH 6.8及以上條件快速降解[5,22],Wang等[5]報道了當(dāng)CCM在0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液和無血清培養(yǎng)基（pH值均為7.2）中37 ℃孵育30 min時,降解率約90%。CCM在食品加工過程以及在經(jīng)人體胃、腸道消化時,均可能經(jīng)歷較寬范圍內(nèi)的pH值變化。本實驗采用體外模型考察了不同種類PG-CCM復(fù)合物在模擬胃、腸液條件下的穩(wěn)定性,同時研究了5% PG-CCM復(fù)合物在不同pH值環(huán)境條件下的貯藏穩(wěn)定性。

2.2.2.1 PG-CCM復(fù)合物在體外模擬胃、腸液條件下的穩(wěn)定性

圖2 PG-CCM復(fù)合物在體外模擬胃、腸液條件下的穩(wěn)定性Fig.2 Stability of PG-CCM complex in SGF and SIF

如圖2A所示,體外模擬胃液（pH 1.2）條件下,5% PG-CCM復(fù)合物中的CCM具有良好的穩(wěn)定性,12 h的保留率高達(dá)97%；在模擬腸液條件下（pH 6.9和pH 7.2）,CCM的降解速率明顯提高,在pH 7.2模擬腸液中尤為明顯；2 h和12 h時分別損失了18%和47%。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步考查了不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PG-CCM復(fù)合物中CCM在pH 7.2模擬腸液條件下的穩(wěn)定性,并與分散于模擬腸液中CCM的穩(wěn)定性相比較,結(jié)果見圖2B。在模擬腸液條件下,3 種PG-CCM復(fù)合物中CCM的降解模式與CCM存在明顯差異,CCM在2 h內(nèi)迅速降解,損失率約42%,之后幾乎不再降解。3 種PG-CCM復(fù)合物均在監(jiān)測的12 h內(nèi)發(fā)生持續(xù)降解,前期降解速率及最終降解程度由低到高依次為5% PG-CCM＜3% PG-CCM＜1% PGCCM；其中,5% PG-CCM降解速率在整個實驗期間均低于CCM,明顯提高了CCM的酸堿穩(wěn)定性。

PG-CCM和CCM在腸液條件下表現(xiàn)出不同的降解趨勢,這一現(xiàn)象可能是CCM的存在狀態(tài)不同造成的。在CCM的固體分散液（20 μg/mL）中,由于CCM水中的溶解度遠(yuǎn)低于1 μg/mL[4,23]；因此,CCM除以極少量游離態(tài)分子存在外,大部分分子因相互作用彼此聚集,形成納米粒或生成結(jié)晶沉淀[2,24-25]。不同存在狀態(tài)的CCM分子穩(wěn)定性有極大差異,Li Bin等[22]報道了結(jié)晶態(tài)CCM分子的降解速率遠(yuǎn)低于溶液中游離的CCM分子。本實驗中,在最初的2 h內(nèi),溶解狀態(tài)的游離分子或聚集較少分子納米粒中的CCM分子發(fā)生快速降解；隨后體系中的CCM主要以結(jié)晶或沉淀形式存在,不容易發(fā)生降解。因此,CCM總體降解規(guī)律表現(xiàn)為前期快速降解,后期維持穩(wěn)定。在PG-CCM體系中,CCM由于與PG相互作用,主要以分子狀態(tài)存在,不發(fā)生結(jié)晶或沉淀；因此,其降解規(guī)律表現(xiàn)為降解速率持續(xù)下降。5% PG-CCM降解速率在12 h監(jiān)測時間內(nèi)均低于CCM,而3% PG-CCM在監(jiān)測前4 h內(nèi)降解速率也低于CCM,對CCM起到較好的保護(hù)作用,有利于CCM在腸道的吸收。

2.2.2.2 5% PG-CCM復(fù)合物貯藏期間的酸堿穩(wěn)定性

圖3 5%PG-CCM復(fù)合物在不同pH值條件下的貯藏穩(wěn)定性Fig.3 Stability of 5% PG-CCM complex under different pH conditions during storage

由圖3可知,隨貯藏時間延長,不同pH值條件下5% PG-CCM復(fù)合物中CCM的保留率均呈顯著下降趨勢；20 d時,pH 3.0～5.0之間,CCM保留率差異不明顯,約為52%～55%；而pH 6.0和pH 6.6時的保留率明顯降低,僅分別為34.91%和16.30%。表明PG-CCM適宜保存在較低pH值的環(huán)境中。

2.3 PG-CCM復(fù)合物中CCM在胃、腸液環(huán)境下的釋放率

圖4 PG-CCM復(fù)合物在體外模擬胃、腸液中的釋放Fig.4 Kinetic release profiles of encapsulated CCM from PG-CCM complex in SGF and SIF

1% PG-CCM、5% PG-CCM在體外模擬胃、腸液環(huán)境中的釋放動力學(xué)結(jié)果如圖4所示,兩種復(fù)合物中CCM的釋放特征明顯不同：1% PG-CCM復(fù)合物中CCM在胃、腸液環(huán)境下的釋放均表現(xiàn)出“前期突釋（0～20 min）、隨后持續(xù)釋放（20 min以后）”的兩相特征,且在胃液中的釋放率明顯高于腸液。20 min時,在胃、腸液的釋放率分別達(dá)到36.8%和17.8%,而后釋放率逐漸增長,至135 min時分別為55.1%和33.9%。5% PG-CCM復(fù)合物中CCM在胃、腸液中的釋放也存在“前期突釋”（0～20 min）現(xiàn)象,但隨后釋放率在整個實驗期間不再增長,保持在15%～20%左右。兩種復(fù)合物相比,1% PG-CCM復(fù)合物中CCM在胃液和腸液中的釋放率均顯著高于5% PG-CCM。

“突釋”部分的CCM通常被認(rèn)為負(fù)載在載體表面,隨后持續(xù)釋放的CCM則代表結(jié)合在載體內(nèi)核中[13,26]。1% PG-CCM復(fù)合物中負(fù)載于納米粒表面的比例遠(yuǎn)高于5% PG-CCM,因此“突釋量”更高；隨后釋放的CCM可認(rèn)為是從納米粒內(nèi)核逐漸向表面轉(zhuǎn)移并釋放到介質(zhì)中。氫鍵是PG和CCM相互作用的主要作用力之一[9],而pH值影響分子間的氫鍵作用[2,4,27]；因此,本研究中模擬胃、腸液pH值的差異是影響PG-CCM中CCM釋放量不同的主要原因。Gangurde等[4]報道了與本研究相類似的CCM釋放現(xiàn)象。

2.4 PG-CCM復(fù)合物的生物活性

2.4.1 抗氧化活性

分散于水中的CCM總還原力較小,且對ABTS陽離子自由基幾乎無清除活性。溶于乙醇的CCM總還原力提高,且表現(xiàn)出較強(qiáng)的ABTS陽離子自由基清除活性。3 種PG-CCM復(fù)合物的總還原力和ABTS陽離子自由基清除活性均高于CCM（無論是分散在水中或溶解于乙醇中）。不同的PG-CCM復(fù)合物相比,總還原力和ABTS陽離子自由基清除活性差異均明顯,但規(guī)律相反：總還原力為1% PG-CCM＞3%PG-CCM＞5%PG-CCM（圖5A）,而對ABTS陽離子自由基清除能力依次為5% PG-CCM＞3% PG-CCM＞1% PG-CCM（圖5B）。

CCM分子結(jié)構(gòu)中的酚羥基和共軛雙鍵使其具有很強(qiáng)的抗氧化活性。但是,CCM的水溶性低,其在水基質(zhì)中的抗氧化活性較差,在有機(jī)溶劑中的抗氧化活性往往高于分散于水的情況[28-29]。本實驗的研究結(jié)果也證實了這一點。本研究同時表明經(jīng)PG負(fù)載后,CCM的抗氧化活性得到進(jìn)一步提高。這可能與下面兩個因素有關(guān)：1）PG-CCM在水中具有良好的分散性；2）PG的納米粒結(jié)構(gòu)提供了極大的外表面積。以上兩方面因素均有利于在水相發(fā)生的反應(yīng)。類似的現(xiàn)象已見文獻(xiàn)[28-30]報道,如Chang Chao等[28]報道了果膠包被的酪蛋白酸鈉/玉米醇溶蛋白復(fù)合物負(fù)載的CCM對ABTS陽離子自由基的清活性顯著高于溶于乙醇或分散于水中的CCM。

值得注意的是,不同的PG-CCM復(fù)合物對ABTS陽離子自由基的清除活性表現(xiàn)出的規(guī)律與穩(wěn)定性相吻合,即載體質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高,CCM的活性越強(qiáng)。但是,總還原力表現(xiàn)出的規(guī)律則正好相反。還原力測定中所用的氧化劑鐵氰化物無法透過疏水區(qū)域,因此廣泛用于測定暴露在水介質(zhì)中的還原性基團(tuán)[30-31]。本研究中,載體PG質(zhì)量分?jǐn)?shù)越大,CCM分布在PG疏水內(nèi)核中的比例越高,分布于表面的CCM越少。鐵氰化物無法透過PG表面進(jìn)入到疏水的內(nèi)核中與之反應(yīng),因此表現(xiàn)出較低的還原力。

圖5 PG-CCM復(fù)合物的抗氧化活性Fig.5 Antioxidant activity of PG-CCM complex

2.4.2 對癌細(xì)胞抑制作用

CCM具有抑制結(jié)腸癌細(xì)胞、口腔鱗癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、人胰腺癌、腎癌細(xì)胞[32]等多種癌細(xì)胞增殖的作用。本實驗研究比較了CCM/H2O組、CCM/DMSO組和1% PG-CCM、5% PG-CCM組對A549 和MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用,結(jié)果如圖6所示。

圖6 PG和CCM對A549和MCF-7細(xì)胞的抑制作用Fig.6 Cytotoxicity of PG on A549 and MCF-7 and cytotoxicity of PGCCM on A549 and MCF-7

PG對兩種細(xì)胞的抑制率均小于15%,表明其對癌細(xì)胞生長的影響可忽略不計（圖6A）。如圖6B、C所示,CCM/H2O對上述兩種癌細(xì)胞的抑制作用較小,并且僅在很低的濃度范圍呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系；當(dāng)濃度超過某一值后（A549為40 μmol/L,MCF-7為20 μmol/L）,抑制率不再發(fā)生明顯變化,維持在較低水平。CCM/DMSO組對兩種細(xì)胞均表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制作用,且具有良好的劑量依賴性；其中,對MCF-7的抑制作用更顯著。兩種PG-CCM復(fù)合物對癌細(xì)胞的抑制率在多數(shù)濃度條件下都明顯高于CCM/H2O。1% PG-CCM對兩種癌細(xì)胞的抑制作用均優(yōu)于5% PG-CCM,其中對A549的抑制作用在濃度大于60 μmol/L時,與CCM/DMSO無明顯差異。

如上所述,CCM水溶性低,達(dá)到飽和濃度后,繼續(xù)增大CCM在水中的量,溶解于水中的CCM分子數(shù)量并不會因此增加,故對癌細(xì)胞的抑制作用也就不再增強(qiáng)。DMSO和PG負(fù)載對CCM均起到增加溶解度的作用,可以提供更多的游離CCM分子與癌細(xì)胞接觸,因此提高了對癌細(xì)胞的抑制作用。與5% PG-CCM復(fù)合物相比,更大比例的CCM分布于1% PG-CCM復(fù)合物納米粒的表層；一方面有利于與癌細(xì)胞直接接觸,另一方面有利于釋放,因此對癌細(xì)胞的抑制作用也更突出。

3 結(jié) 論

CCM負(fù)載于PG后的紫外穩(wěn)定性、抗氧化活性及癌細(xì)胞抑制活性均顯著增強(qiáng)。PG-CCM制備時使用的PG濃度極大影響CCM的負(fù)載特征、釋放曲線、CCM的穩(wěn)定性以及生物活性。5% PG-CCM復(fù)合物的紫外穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性均顯著優(yōu)于1% PG-CCM,其中5% PG-CCM與CCM相比,顯著提高了CCM的酸堿穩(wěn)定性。1% PG-CCM在胃液和腸液中的釋放率和對兩種癌細(xì)胞的抑制作用均高于5% PG-CCM。兩種復(fù)合物穩(wěn)定性、釋放特性及生物活性的差異與CCM在PG中的分布狀態(tài)有關(guān)。