孫祥敏，駱 丹，杜建冬，吳艷麗，張 云，郭飛虎

(原子高科股份有限公司，北京 102413)

氟[18F]化鈉注射液是一種用于骨顯像的正電子放射性藥物。該藥物由靜脈注射進入血液系統(tǒng)后，可選擇性的吸附于骨骼系統(tǒng)，是一種優(yōu)良的骨顯像劑，能夠高靈敏度、高特異性地對腫瘤骨轉移進行早期診斷和檢測復發(fā)[1-3]，也能夠有效鑒別破裂斑塊和高風險的冠狀動脈粥樣硬化斑塊[4]。目前我國并未有該產品上市，因此對該產品的開發(fā)研究具有較廣闊的市場前景和社會意義。新藥質量研究作為新藥開發(fā)的重要組成部分，是保障藥品安全性、有效性的基礎。細菌內毒素和微生物進入人體后會引起嚴重的后果，嚴重時甚至會引起死亡[5-6]，因此細菌內毒素檢查和無菌檢查對注射劑的安全性尤為重要。目前國內尚未有氟[18F]化鈉注射液細菌內毒素檢查和無菌檢查相關質量標準和具體檢驗方法的收載，因此，對該產品的細菌內毒素檢查、無菌檢查的相關質量標準和具體檢驗方法的研究對保障用藥安全具有十分重要的作用。

氟[18F]化鈉注射液為放射性藥品，放射性藥品具有生產批量小、樣品存在放射性等特點，要求檢驗快速有效[7]，另外還需考慮操作時間對人員輻照劑量的影響和放射性廢物處理等因素。細菌內毒素檢查宜采用凝膠限度法，無菌檢查宜采用直接接種法。本文對氟[18F]化鈉注射液產品的細菌內毒素檢查和無菌檢查方法進行研究，建立適宜于該產品的檢驗方法，以保證檢驗結果的準確可靠，對產品質量進行控制，保障用藥安全。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器

TAL-40D型試管恒溫儀：湛江安度斯生物有限公司；XW-80A型旋渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；DHG-9145A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；BSC-1600IIB2型生物安全柜：蘇州安泰空氣技術有限公司；RT1600S型隔離器：浙江泰林生物技術股份有限公司；YXQ-LS-100SII型壓力蒸汽滅菌器、恒溫培養(yǎng)箱(BSP-250型、SPX-250C型)：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；MP1100B型電子天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.2 主要材料與試劑

氟[18F]化鈉注射液：原子高科股份有限公司提供；細菌內毒素工作標準品：80 EU·支-1，中國食品藥品檢定研究院提供；細菌內毒素檢查用水(BET水)：湛江安度斯生物有限公司產品；鱟試劑：0.5 EU·mL-1，湛江安度斯生物有限公司產品(批號1406032)和廈門鱟試劑實驗廠有限公司產品(批號150103)；菌珠：103·顆-1，4代，北京三藥科技開發(fā)公司產品；培養(yǎng)基：北京三藥科技開發(fā)公司產品；0.9%氯化鈉注射液：石家莊四藥有限公司產品。

2 實驗方法

2.1 細菌內毒素檢查方法

2.1.1細菌內毒素限值(L) 按公式L=K/M[8]計算。其中，K為人每千克體重每小時最大可接受的內毒素劑量，放射性藥品注射劑K=2.5 EU/(kg·h)；M為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量，人均體重按60 kg計算，注射時間不足1 h，按1 h時計算。

2.1.2鱟試劑靈敏度復核 取細菌內毒素工作標準品用1 mL BET水復溶后，在旋渦混合器上混勻15 min，逐步稀釋制備2λ、λ、0.5λ、0.25λ的內毒素標準溶液(λ為鱟試劑靈敏度標示值)，每步稀釋均混勻30 s以上。每批鱟試劑，各取18支進行實驗。其中16支分別用0.1 mL BET水復溶，然后分別加入0.1 mL濃度為2λ、λ、0.5λ、0.25λ的內毒素標準溶液，每個濃度平行做4支；剩余2支，每支加入0.2 mL BET水，作為陰性對照(NC)?；靹?，(37±1) ℃恒溫培養(yǎng)(60±2) min。若2λ管均為陽性(+)，0.25λ管均為陰性(-)，NC均為(-)時，實驗有效。計算鱟試劑靈敏度測定值λc=antilg(∑X/4)(X為反應終點濃度的對數(shù)值)。λc在0.5λ～2λ范圍內時，該批鱟試劑符合規(guī)定，并以標示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。

2.1.3最大有效稀釋倍數(shù)(MVD) 按公式MVD=cL/λ計算。其中c為供試品溶液濃度，當L以EU/mL表示時，c為1.0 mL/mL。

2.1.4預干擾實驗 選用0.5 EU·mL-1的鱟試劑進行實驗。將供試品溶液以BET水稀釋至不同濃度。供試品溶液組(NPC)，每個濃度平行兩管，每管以0.1 mL BET水復溶鱟試劑，然后加入0.1 mL供試品溶液；供試品陽性對照組(PPC)，每個供試品濃度平行兩管，每管以0.1 mL 2λ細菌內毒素標準溶液復溶鱟試劑，然后加入0.1 mL供試品溶液；陽性對照(PC)，平行兩管，每管以0.1 mL BET水復溶鱟試劑，然后加入0.1 mL 2λ細菌內毒素標準溶液；陰性對照組(NC)，平行兩管，每管加入0.2 mL BET水?；靹颍?37±1) ℃恒溫培養(yǎng)(60±2) min。當NPC、NC平行管均為陰性(-)，PC均為陽性(+)時，實驗有效。PPC中第一個出現(xiàn)陽性結果的濃度即初步將其判斷為樣品的無干擾濃度。

2.1.5干擾實驗 以兩個廠家的鱟試劑進行實驗[9]。對于每批鱟試劑，供試品溶液組平行兩管，每管用0.1 mL BET水復溶鱟試劑，然后加入0.1 mL供試品溶液；干擾實驗系列，每管加入0.1 mL供試品溶液，然后加入0.1 mL內毒素標準溶液(共四個濃度2λ、λ、0.5λ、0.25λ)，每個濃度平行四管；鱟試劑標示靈敏度對照系列，每管用0.1 mL BET水復溶鱟試劑，然后加入0.1 mL內毒素標準溶液(共四個濃度2λ、λ、0.5λ、0.25λ)，每組平行兩管；陰性對照組平行兩管，每管加入0.2 mL BET水。(37±1) ℃恒溫培養(yǎng)(60±2) min。按公式計算BET水和供試品稀釋液反應終點濃度的幾何平均值(Es和Et)。Es=antilg(∑Xs/2)，Et=antilg(∑Xt/4)。Es和Et值均在0.5λ～2λ范圍內時，判定供試品在該濃度下無干擾。

2.1.6氟[18F]化鈉注射液細菌內毒素檢查 采用建立好的內毒素檢查方法，對氟[18F]化鈉注射液進行細菌內毒素檢驗。對于每批次供試品的檢查，取8管鱟試劑進行實驗。其中2管為供試品溶液組(S)，每管以0.1 mL BET水復溶鱟試劑，然后加入0.1 mL供試品溶液；2管為供試品陽性對照組(PPC)，每管加入0.1 mL供試品溶液，然后加入0.1 mL濃度為2λ內毒素標準溶液；2管為陽性對照組(PC)，每管用0.1 mL BET水復溶鱟試劑，然后加入0.1 mL濃度為2λ內毒素標準溶液；2管為陰性對照組(NC)，每管加入0.2 mL BET水。(37±1) ℃恒溫培養(yǎng)(60±2) min。NC平行管均為(-)，PPC、PC平行管均為(+)，實驗有效；S均為(-)，判供試品符合規(guī)定。

2.2 無菌檢查方法

2.2.1菌液制備 金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉菌珠均以1.1 mL 0.9%氯化鈉注射液溶解，靜置約30 s，旋渦混合5～10 s，然后取1 mL菌液加入9 mL 0.9%氯化鈉注射液進行10倍稀釋。

2.2.2菌落計數(shù) 金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌的計數(shù)采用胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；白色念珠菌、黑曲霉的計數(shù)采用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。每皿加入0.3 mL菌液，澆注20 mL約45 ℃的培養(yǎng)基，混勻，冷卻凝固后，倒置培養(yǎng)，每種實驗菌平行制備兩個平板。另以稀釋液代替菌液同法操作作為陰性對照。生孢梭菌放入?yún)捬醮袇捬跖囵B(yǎng)。接種后的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板置33 ℃培養(yǎng)3 d，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板置24 ℃培養(yǎng)5 d，觀察結果，點計菌落數(shù)。

2.2.3培養(yǎng)基適用性檢查 培養(yǎng)基適用性檢查包括無菌性檢查和靈敏度檢查[10]。取11支裝量為12 mL的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基(FTM)，分別接種0.3 mL的金黃色葡萄球菌、生孢梭菌、銅綠假單胞菌菌液各2支，另5支不接種作為培養(yǎng)基無菌性檢查用，加菌管33 ℃培養(yǎng)3 d，無菌檢查管培養(yǎng)14 d；取11支裝量為9 mL的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)，分別接種0.3 mL的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌菌液、黑曲霉孢子懸液各2支，另5支不接種作為培養(yǎng)基無菌性檢查用，加菌管24 ℃培養(yǎng)5 d，無菌檢查管培養(yǎng)14 d。當加菌培養(yǎng)基管均生長良好，無菌性檢查管均無菌生長，可判培養(yǎng)基適用性檢查均符合規(guī)定。

2.2.4方法適用性實驗和產品無菌性檢查 取3批氟[18F]化鈉注射液進行實驗。對于每批產品的無菌檢查方法適用性實驗，取6管裝量為7.5 mL的FTM，分別接入小于100 cfu的金黃色葡萄球菌、生孢梭菌、大腸埃希菌各2管；取6管裝量為7.5 mL的TSB，分別接入小于100 cfu的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接種0.2 mL的供試品，另一管不接種作為對照。另取FTM、TSB各2管，每管接入0.2 mL的供試品作為供試品的無菌檢查。方法適用性用FTM管置33 ℃培養(yǎng)3 d，TSB管置24 ℃培養(yǎng)5 d，無菌檢查管培養(yǎng)14 d，逐日觀察結果。陽性對照管生長良好，與陽性對照管相比，供試品陽性對照管均生長良好，則該檢驗量在該檢驗條件下無干擾。無菌檢查管溶液澄清、無菌生長，則供試品無菌檢查符合規(guī)定。

3 結果與討論

3.1 細菌內毒素檢查方法

3.1.1細菌內毒素限值(L) 氟[18F]化鈉注射液最大給藥體積為10 mL，注射時間小于1 h，計算M=10 mL/(60 kg·h)；放射性藥品注射劑K=2.5 EU/(kg·h)，計算L=K/M=15 EU·mL-1。氟[18F]化鈉注射液的L定為15 EU·mL-1。

3.1.2鱟試劑靈敏度復核 對批號為1406032和150103，λ為0.5 EU/mL的鱟試劑進行靈敏度復核實驗，實驗結果列于表1。2批鱟試劑的λc均在0.5～2.0λ范圍內，鱟試劑靈敏度復核均符合規(guī)定，可用于細菌內毒素檢查。

3.1.3最大有效稀釋倍數(shù)(MVD) 目前用于藥品檢驗的鱟試劑靈敏度一般在0.03～0.5 EU·mL-1之間，氟[18F]化鈉注射液的L=15 EU·mL-1，按公式MVD=cL/λ計算所對應的MVD為30到480倍(表2)。

3.1.4預干擾實驗 取一批次氟[18F]化鈉注射液，用BET水稀釋制成10倍、30倍、60倍、120倍的供試品溶液進行實驗。結果列于表3。預實驗結果初步表明，將供試品稀釋10倍后對細菌內毒素實驗無干擾作用。

表1 鱟試劑靈敏度復核Table 1 The confirmation of the labelled lysate sensitivity

表2 最大有效稀釋倍數(shù)Table 2 The maximum valid dilution

表3 氟[18F]化鈉注射液預干擾實驗結果Table 3 Results of interference advance tests of Na18F

3.1.5干擾實驗 將連續(xù)生產的三批氟[18F]化鈉注射液稀釋10倍進行實驗，各批次放射性濃度均合格(合格標準為0.37～7.40 GBq/mL)，放射性濃度分別為1.59 GBq/mL(20160406-1)、1.03 GBq/mL(20160407-1)、0.93 GBq/mL(20160407-2)。實驗結果列于表4。各組Es和Et值均在0.5λ～2λ范圍內，將氟[18F]化鈉注射液稀釋10倍，對不同廠家的鱟試劑與內毒素的反應均無干擾作用，可以采用將供試品至少稀釋10倍進行該產品的細菌內毒素檢查。

表4 氟[18F]化鈉注射液干擾實驗結果Table 4 Results of interference tests of Na18F

3.1.6氟[18F]化鈉注射液細菌內毒素檢查 采用0.5 EU·mL-1的鱟試劑，將供試品直接稀釋30倍進行實驗。3批次氟[18F]化鈉注射液的細菌內毒素檢查結果見表5。結果均符合規(guī)定。

表5 氟[18F]化鈉注射液細菌內毒素檢查結果Table 5 Results of bacterial endotoxin test of Na18F

3.2 無菌檢查方法

3.2.1菌落計數(shù) 對所采用的商業(yè)菌株進行濃度測定，每種實驗菌取0.3 mL的10倍稀釋液進行計數(shù)，實驗結果見表6。實驗結果表明，各實驗菌的接種體積均采用0.3 mL時，接種菌量均小于100 cfu。

表6 菌液計數(shù)結果Table 6 Results of colony counting

3.2.2培養(yǎng)基適用性檢查 對無菌檢查用培養(yǎng)基進行培養(yǎng)基適用性檢查，無菌性檢查各管均無菌生長，靈敏度檢查各管均生長良好，培養(yǎng)基適用性檢查均符合規(guī)定，可用于供試品的檢驗。

3.2.3方法適用性實驗和產品無菌性檢查 取3批氟[18F]化鈉注射液進行實驗。實驗結果列于表7、表8。實驗結果表明，與對照管相比，三批含供試品的培養(yǎng)基管中各實驗菌均生長良好，接種0.2 mL供試品至7.5 mL培養(yǎng)基管中進行無菌檢查時無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計。對三批產品進行無菌檢查均合格。

表7 方法適用性實驗Table 7 The method suitability test

表8 無菌檢查Table 8 The sterility test

4 結論

本研究根據(jù)藥品劑型和用藥情況，制定了內毒素檢查和無菌檢查質量標準，其中細菌內毒素限值為15 EU·mL-1，無菌檢查應無菌生長。建立了氟[18F]化鈉注射液細菌內毒素檢查方法和無菌檢查方法，可用于該產品的質量檢驗、對產品質量進行控制，確保用藥安全。

氟[18F]化鈉注射液采用凝膠限度法進行細菌內毒素檢驗時，須將供試品稀釋至少10倍進行檢驗。該法操作簡便、快捷，且成本較低，是目前放射性藥品常用的檢測方法。

氟[18F]化鈉注射液的無菌檢查可以采用直接接種0.2 mL供試品至7.5 mL培養(yǎng)基管中進行無菌檢查的方法。該方法操作簡單，產生廢物量小，適宜于該產品的無菌檢查。

在方法驗證實驗中，均為生產結束后，即時取樣進行實驗，射線對檢驗影響較小。該產品屬正電子類放射性藥品，細菌內毒素檢查和無菌檢查可進行追溯性檢驗[10]，為避免檢驗人員受到過量電離輻射，可將樣品進行適當衰變后進行檢驗。