張 鵬，陳 媛，羅 維*

(1.華南理工大學(xué) 分析測試中心，廣東 廣州 510641;2.工業(yè)和信息化部電子第五研究所 電子元器件可靠性物理及其應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510610)

液相擴(kuò)散系數(shù)是研究分子傳質(zhì)過程、傳質(zhì)速率的重要基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。自擴(kuò)散系數(shù)的大小與溶質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)及其所處介質(zhì)環(huán)境有關(guān)。通過測定自擴(kuò)散系數(shù)，可以定性或定量表征液相分子的相關(guān)物理化學(xué)性質(zhì)，例如分子尺寸、分子量、聚集狀態(tài)及分子間相互作用等。核磁共振技術(shù)是化合物結(jié)構(gòu)及成分測定的有效手段，在物理、化學(xué)、生物、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。1950年，Hahn提出“自旋回波”的概念[1]，并闡明了在非均勻磁場中擴(kuò)散效應(yīng)對回波幅度的影響，奠定了核磁共振擴(kuò)散研究的理論基礎(chǔ)。隨著核磁共振技術(shù)軟硬件的發(fā)展，基于脈沖場梯度(Pulsed field gradient ,PFG)的核磁共振研究以其快速、無損、樣品用量少、受雜質(zhì)影響小等特點(diǎn)，成為測量液體及溶液樣品自擴(kuò)散系數(shù)的重要手段。

1991年，Johnson等率先開發(fā)了一種用于直觀展現(xiàn)擴(kuò)散系數(shù)的偽二維譜[2]，即擴(kuò)散序譜(DOSY)。其中一維是化學(xué)位移，另一維是擴(kuò)散系數(shù)(D或者logD)，可分別通過衰減信號(hào)的傅立葉變換和拉普拉斯變換產(chǎn)生，且不同分子的信號(hào)按照擴(kuò)散系數(shù)大小依次排序。由于DOSY非常適合用于分析溶液中的小分子混合物與生物分子，因而很快為化學(xué)、生物等領(lǐng)域的科學(xué)家所接受。二維DOSY中最常用的是1H-DOSY，因?yàn)?H原子核具有較大的磁旋比，天然豐度高、信號(hào)強(qiáng)。但1H NMR譜寬較窄，在某些復(fù)雜混合物中信號(hào)重疊嚴(yán)重。為了提高化學(xué)位移維的分辨率，研究人員將DOSY實(shí)驗(yàn)拓展到其他原子核，例如：7Li、13C、19F、23Na、31P、119Sn、133Cs、195Pt等等[3-9]。與氫核相比，這些原子核的化學(xué)位移范圍更寬，弛豫時(shí)間長、線寬窄、無自旋耦合(或很少自旋耦合)，能夠顯著提高DOSY譜圖的分辨率。但其磁旋比較低，梯度效率損失過大。王英雄課題組[10]利用低溫1H- 和19F-DOSY研究糖基化反應(yīng)中的活性中間體，19F-DOSY大大降低了譜圖的復(fù)雜程度，提供了更多關(guān)于反應(yīng)路徑的信息。

Gorenstein首先提出了三維DOSY(3D-DOSY)的概念[11]，并將DOSY與二維譜奧氏核效應(yīng)效換相關(guān)譜(NOESY)聯(lián)用，成功地解決了DNA雙鏈體和二核苷酸譜峰重疊的問題。此后，3D-DOSY 發(fā)展迅速，幾乎所有類型的二維譜都能與DOSY結(jié)合使用，例如：同核化學(xué)位移相關(guān)譜(COSY)[12-14]、全相關(guān)譜(TOCSY)[15-16]、異核單量子相關(guān)譜(HSQC)[16]、異核多量子相關(guān)譜(HMQC)[17]和J分辨譜(J-Res)[14,18]等。DOSY可以區(qū)分?jǐn)U散系數(shù)差異為1%的化合物。但在信號(hào)重疊時(shí)，DOSY的效果不佳，此時(shí)需要借助分子間相互作用，擴(kuò)大被分析物擴(kuò)散系數(shù)的差別。通常的做法是向混合物中加入更多的共溶質(zhì)或基質(zhì)，以選擇性地調(diào)節(jié)分子的擴(kuò)散行為[19-21]，最終實(shí)現(xiàn)擴(kuò)大各組分?jǐn)U散系數(shù)差異的目的，這種方法被稱為基質(zhì)輔助DOSY。合適的基質(zhì)是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵，常見的基質(zhì)[19]有硅納米粒子類、聚合物類、表面活性劑類、微乳液類，等等。黃少華等[22]研究發(fā)現(xiàn)聚二甲基硅氧烷(PDMS)對大部分類型有機(jī)分析物都具有顯著的分離能力，是一類理想的通用型基質(zhì)?；|(zhì)輔助DOSY可用于同分異構(gòu)體的分析，包括分離位置異構(gòu)體、對映異構(gòu)體、差向異構(gòu)體等。例如王英雄等[23]以Ga2+離子為基質(zhì)，成功區(qū)分出D-葡萄糖的α-和β-端基異構(gòu)體。

目前DOSY實(shí)驗(yàn)主要應(yīng)用于以下4個(gè)方面：(1)用于復(fù)雜混合物的成分分析。依據(jù)不同分子擴(kuò)散快慢，鑒定藥物[24-26]、膳食補(bǔ)充劑[27-28]、食品[29-32]、飲料[33-38]以及生物提取物[39-43]中的各基質(zhì)成分；(2)測量分子的大小[44-46]，例如納米顆粒尺寸等；(3)測量分子量[47-53]，例如高分子聚合物中的分子量分布等；(4)研究化學(xué)、生物系統(tǒng)中溶液分子間的相互作用[54-55]，評估主體與客體分子之間的締合常數(shù)[56-57]。

圖1 脈沖場梯度自旋回波(PFGSE)序列[58]Fig.1 Pulsed field gradient spin echo(PFGSE) sequence[58]red,green and blue represent the gradient pulse intensity of 2%,50% and 95%,respectively(紅、綠、藍(lán)分別代表2%、50%、95%的梯度脈沖強(qiáng)度)

1 脈沖場梯度及脈沖序列的發(fā)展

1.1 脈沖場梯度

脈沖場梯度是DOSY實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，可以在分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)與場梯度強(qiáng)度之間建立明確的數(shù)學(xué)關(guān)系。圖1所示是1H-DOSY實(shí)驗(yàn)最基礎(chǔ)的脈沖場梯度自旋回波(PFGSE)序列，由射頻脈沖及場梯度脈沖組成。場梯度的主要作用是進(jìn)行空間定位，包括相位編碼及頻率編碼，可通過場梯度明確空間上的任意位置。而射頻脈沖主要用于發(fā)射及采集信號(hào)，通過回波信號(hào)來了解樣品的特性。

圖2描述了PFGSE脈沖序列下，原子核磁化強(qiáng)度矢量的演化行為，圖1和圖2中不同強(qiáng)度的梯度脈沖通過顏色一一對應(yīng)。第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)90°x射頻脈沖將磁化強(qiáng)度矢量沿x-y平面的x方向?qū)R(黑色箭頭)，各自旋相位相干。第一個(gè)梯度脈沖將磁化強(qiáng)度矢量沿x-y平面和z軸扭曲為螺旋形狀，即編碼。所謂“編碼”指脈沖場梯度通過與空間呈線性關(guān)系的相位角，記錄各自旋所處的位置。磁化強(qiáng)度矢量的螺旋程度取決于梯度脈沖的強(qiáng)度和脈寬。兩個(gè)梯度脈沖之間的時(shí)間稱為擴(kuò)散時(shí)間Δ(紫色)，樣品在該段時(shí)間內(nèi)進(jìn)行自擴(kuò)散，不同組分按各自速率自由擴(kuò)散。擴(kuò)散時(shí)間Δ期間，施加一個(gè)180°x射頻脈沖，有抵消磁場不均勻性的作用。演化時(shí)間之后，通過第二個(gè)梯度脈沖“解碼”。因此，磁化強(qiáng)度矢量的相位變化是兩次梯度脈沖以及180°x射頻脈沖共同作用的結(jié)果。在沒有擴(kuò)散作用及橫向弛豫的理想情況下，螺旋會(huì)被完美的退繞并返回同相自旋，從而可以探測到最大回波信號(hào)。在實(shí)際情況下，由于分子擴(kuò)散等作用的影響，兩個(gè)梯度脈沖引起的相位變化不會(huì)完全抵消。僅一部分的磁化強(qiáng)度矢量(較小的箭頭/圓圈)被第二個(gè)解碼脈沖恢復(fù)(顏色編碼與第一個(gè)梯度脈沖的梯度強(qiáng)度匹配)。因此，擴(kuò)散會(huì)導(dǎo)致信號(hào)強(qiáng)度降低，信號(hào)衰減取決于螺旋螺距Λ，即取決于梯度脈沖強(qiáng)度(g)和脈寬(δ)，公式表達(dá)為：

I=I0exp[-Dγ2g2δ2(Δ-δ/3)-R]

(1)

I為觀察到的信號(hào)強(qiáng)度，I0為不加場梯度時(shí)的信號(hào)強(qiáng)度，D為擴(kuò)散系數(shù)，γ為旋磁比，Δ為擴(kuò)散時(shí)間，R為考慮弛豫的常數(shù)項(xiàng)，對于PFGSE脈沖序列而言，R=2τ/T2(τ為射頻脈沖間隔時(shí)間，T2為橫向馳豫時(shí)間)。如圖2所示，梯度功率越高(綠色：50%，藍(lán)色：95%)回波信號(hào)強(qiáng)度越小。改變梯度脈沖強(qiáng)度g，可采集到衰減程度不同的一組譜峰，經(jīng)指數(shù)擬合便可求得擴(kuò)散系數(shù)D。通過對化學(xué)位移軸上數(shù)據(jù)點(diǎn)對應(yīng)的擴(kuò)散系數(shù)進(jìn)行拉普拉斯變換[59]，可得到二維DOSY譜，f1維代表擴(kuò)散系數(shù)(D或者logD)，f2維代表化學(xué)位移。

圖2 磁化強(qiáng)度在PFGSE脈沖序列下的演化過程圖示[58]Fig.2 Evolution process of magnetization under the PFGSE pulse sequence[58]

圖3 基于場梯度的脈沖序列[55]Fig.3 Pulse sequence based on field gradient[55]A.SE[60]；B.STE[61]；C.LED[2]；D.BPPLED[63]

1.2 DOSY脈沖序列研究進(jìn)展

隨著連續(xù)波核磁共振波譜發(fā)展為脈沖傅立葉變換波譜，核磁共振擴(kuò)散研究在脈沖序列開發(fā)上取得了長足的進(jìn)步，圖3給出了幾種常見脈沖序列的時(shí)序圖。Tanner和Stejskal率先實(shí)現(xiàn)了基于脈沖場梯度的自旋回波實(shí)驗(yàn)[60]，采用的脈沖序列簡稱為PFGSE(Pulsed field gradient spin echo)。該脈沖序列遵從自旋-自旋弛豫，即橫向弛豫T2。對于某些研究對象(例如黏度較大的高分子溶液等)，橫向弛豫時(shí)間過短，遠(yuǎn)小于測量所需的分子擴(kuò)散演化時(shí)間(通常為幾百毫秒量級)，從而導(dǎo)致回波信號(hào)嚴(yán)重衰減、難以檢測。為了解決這個(gè)問題，Tanner提出了基于脈沖場梯度的受激回波PFGSTE(Pulsed field gradient stimulated echo)[61]脈沖序列。在該脈沖序列作用下，磁化矢量大部分時(shí)間在z軸演化，橫向弛豫T2的影響減小，縱向弛豫T1占據(jù)主導(dǎo)[62]。對于大多數(shù)T1≥T2的體系，該序列能減小弛豫時(shí)間對信號(hào)強(qiáng)度的影響，因此大大提高了實(shí)驗(yàn)靈敏度。

早期核磁共振譜儀的探頭使用大量金屬材料，但梯度脈沖的快速上升/下降會(huì)在探頭內(nèi)部產(chǎn)生“渦流”，導(dǎo)致譜圖相位畸變、譜峰重疊。Gribbs等在PFGSTE序列的基礎(chǔ)上，開發(fā)了縱向渦流延遲脈沖序列LED(Longitudinal eddy-current delay)，大大提高了DOSY實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性[2]。Wu等[63]將雙極梯度脈沖(BPP)與LED組合使用，成功地減小了95%的渦流。與LED實(shí)驗(yàn)相比，BPPLED脈沖序列將有效梯度輸出增加了一倍，能用來測量相對較低的擴(kuò)散系數(shù)。近年來商業(yè)化探頭的屏蔽越來越成熟，梯度技術(shù)不斷提高，渦流的影響已微乎其微，使用常規(guī)的自旋回波(SE)、受激回波(STE)脈沖場梯度序列即能得到很好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。另一方面，NMR脈沖設(shè)計(jì)的經(jīng)驗(yàn)法則是，更多的脈沖等于更低的靈敏度[58]。如果實(shí)驗(yàn)不需要用到長脈沖序列的某些特殊優(yōu)點(diǎn)，那么應(yīng)盡量避免選擇很長的脈沖序列，以提高信噪比、縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間。因此，LED和BPPLED序列的使用有所減少。

核磁管中的對流是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的另一個(gè)重要因素，低黏度、低沸點(diǎn)的溶劑(例如：氯仿)易受溫度梯度影響，產(chǎn)生對流，影響數(shù)據(jù)質(zhì)量。Müller等[64]設(shè)計(jì)了兩個(gè)串聯(lián)的PFGSTE脈沖序列，可以有效地消除對流影響。布魯克譜儀采用了這種設(shè)計(jì)，其標(biāo)準(zhǔn)脈沖程序庫中的dstebpgp3s序列包含一個(gè)雙STE片段，該片段具有3個(gè)擾流梯度[64]，非常適合處理核磁管中的對流，但靈敏度不高。劉買利等[65]提出了基于雙PFGSE的雙脈沖梯度場多自旋回波(DMSE)序列，可以有效地消除溶劑對流、背景場梯度、自旋-自旋耦合等因素的影響，準(zhǔn)確測定小分子代謝物的擴(kuò)散系數(shù)，適用于復(fù)雜生物樣品。隨著核磁共振技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的脈沖序列被開發(fā)出來，用于滿足擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)現(xiàn)實(shí)應(yīng)用的需要，例如：減小J耦合影響[66-67]、壓制溶劑峰[68]、減少相位循環(huán)[69-70]、擴(kuò)大擴(kuò)散系數(shù)測量范圍[71-72]等。研究人員可以根據(jù)樣品特點(diǎn)及需要，選擇合適的脈沖序列。

值得注意的是，實(shí)驗(yàn)參數(shù)的設(shè)置對測試結(jié)果有較大影響，主要影響因素[58]包括：脈沖序列類型、場梯度脈沖強(qiáng)度g、擴(kuò)散延遲時(shí)間Δ、脈寬δ、梯度步長、擴(kuò)散擬合程序等等。研究人員有必要深入了解研究對象與脈沖程序之間的匹配程度，針對不同類型的樣品，選取合適的信號(hào)采集及處理程序。

2 應(yīng)用領(lǐng)域及研究進(jìn)展

2.1 擴(kuò)散系數(shù)D

溶液中分子的擴(kuò)散速度受分子大小、形狀、分子量以及濃度、溫度、溶劑等因素的影響。當(dāng)外界條件固定時(shí)，不同種類的分子在相同環(huán)境中將表現(xiàn)出不同的擴(kuò)散系數(shù)，基于此可以區(qū)分混合物中的各個(gè)組分，例如：藥物、膳食補(bǔ)充劑、食品和其他復(fù)雜物質(zhì)(植物提取物、動(dòng)物/人類生物基質(zhì)等)。2005年以來，已有多篇DOSY用于混合物鑒別的綜述，內(nèi)容非常詳盡[56,73-75]，本文簡單介紹其中幾種典型的應(yīng)用。

在藥物領(lǐng)域，DOSY常用于鑒別假冒偽劣制品，例如抗生素[76]、抗抑郁藥[77]、緊急避孕藥[78]、抗瘧藥[79]等。DOSY可同時(shí)提供活性藥物成分(API)和賦形劑的信息，給出藥物制劑各組分的化學(xué)指紋。研究人員發(fā)現(xiàn)市場上偽造最多的是用于治療性功能障礙的藥物[80]，例如“西力士”和“偉哥”。將真品藥物與仿制藥進(jìn)行比較，大多數(shù)制劑都含有效的API成分，正品與仿制品之間的區(qū)別在于含有不同的賦形劑。而某些緊急避孕片劑[78]、抗瘧疾[79]藥物中，含有錯(cuò)誤的API甚至不含API，將會(huì)嚴(yán)重影響服用者的健康。在我國某農(nóng)村地區(qū)出現(xiàn)了一種名為“止痛膠囊”的藥品，未標(biāo)明成分及含量，存在用藥安全隱患。鄧志威等[81]通過DOSY測試手段發(fā)現(xiàn)其中4種主要成分，結(jié)合其他譜圖確定其API成分為對乙酰氨基酚、布洛芬。

中草藥化學(xué)成分復(fù)雜，需經(jīng)過繁瑣的分離純化過程以鑒別其中的活性成分。本課題組[82]對余甘子活性成分進(jìn)行了提取分離，利用一維、二維NMR鑒定了18種化合物結(jié)構(gòu)。唐亞林等[83-85]借鑒組學(xué)概念，將DOSY與生物靶分子的識(shí)別結(jié)合，進(jìn)行天然抗腫瘤化合物的快速篩選和結(jié)構(gòu)鑒定。在川黃柏皮、黃連根莖等提取物溶液中加入生物靶分子，活性小分子與大分子結(jié)合后擴(kuò)散變緩，兩者對應(yīng)信號(hào)處于相同擴(kuò)散帶，由此明確了活性小分子的特征譜峰，進(jìn)一步通過HSQC、異核多鍵相關(guān)譜(HMBC)實(shí)驗(yàn)鑒定了活性小分子的結(jié)構(gòu)。陳忠等[86]應(yīng)用DOSY原位分析丹參混合液，高效、準(zhǔn)確地確定了其主要成分丹參素鈉、丹參酮。陳福欣等[87]利用DOSY詳細(xì)研究了黃芪和左金丸對α-糖苷酶的抑制作用。

在高分子領(lǐng)域，DOSY常被用于評估共聚物的聚合狀態(tài)。若DOSY譜圖中顯示多組不同擴(kuò)散系數(shù)的信號(hào)，表明共聚物中存在單體雜質(zhì)或均聚物混合物。本中心核磁組為多個(gè)課題組提供了DOSY測試支撐[88-90]，以丙交酯(LA)、環(huán)氧乙烷(EO)、酞酐(PA)的三元共聚物PLA-b-P(PA-alt-EO)-b-PLA為例[88]，如圖4A所示，聚丙交酯(PLA)、環(huán)氧乙烷與酞酐交替共聚物P(PA-alt-EO)的混合物表現(xiàn)出兩組不同擴(kuò)散系數(shù)的信號(hào)，D=1.86×10-10m2/s處歸屬為P(PA-alt-EO)，D=1.37×10-10m2/s處歸屬為PLA，與之相對應(yīng)的是三元共聚物PLA-b-P(PA-alt-EO)-b-PLA在圖4B上只呈現(xiàn)一組信號(hào)(D=1.41×10-10m2/s)。結(jié)合核磁氫譜、排阻色譜等實(shí)驗(yàn)手段，證明成功制備了該三元共聚物。

圖4 PLA與P(PA-alt-EO)摻雜的混合物(A)及反應(yīng)后的三嵌段共聚物PLA-b-P(PA-alt-EO)-b-PLA(B)的1H-DOSY譜圖[88]Fig.4 1H-DOSY spectra[88]of a blend of P(PA-alt-EO) and PLA(A) and the PLA-b-P(PA-alt-EO)-b-PLA triblock terpolymer(B)

擴(kuò)散系數(shù)的改變也能反映分子絡(luò)合或組裝程度的變化。在主客體識(shí)別的體系中，往往通過改變物質(zhì)的濃度、觀察擴(kuò)散系數(shù)隨濃度的變化來表征分子間相互作用、微觀結(jié)構(gòu)的變化。以微乳液為例[91-92]，O/W型微乳液中Doil?Dwater(通常Doil為10-11m2/s量級，Dwater為10-9m2/s量級)，W/O型微乳液中Dwater?Doil，在雙連續(xù)型微乳液中Dwater和Doil都很高(約為10-9m2/s)，并且數(shù)值非常接近。如果水和油的相對D值相差一個(gè)以上數(shù)量級，則意味著緩慢擴(kuò)散溶劑中含有離散顆粒；如果它們具有相同的數(shù)量級，則意味著存在雙連續(xù)結(jié)構(gòu)。

2.2 流體動(dòng)力學(xué)半徑RH

DOSY可用于測量納米粒子[93]、表面活性劑膠束[94]、脂蛋白[33-34]、超分子聚集體[35-36]、低聚糖[95]等粒子的尺寸。粒子尺寸與擴(kuò)散系數(shù)密切相關(guān)[44-46]，可以利用斯托克斯-愛因斯坦公式(2)來估算擴(kuò)散粒子的流體動(dòng)力學(xué)半徑(也稱為斯托克斯半徑)RH：

RH=kT/(6πηD)

(2)

式中，k是玻爾茲曼常數(shù)，T是絕對溫度，η是介質(zhì)的粘度。公式假設(shè)一個(gè)膠體尺寸的硬球形顆粒(直徑遠(yuǎn)高于溶劑的球形顆粒)在連續(xù)流體中勻速移動(dòng)。對于較大形狀的分子，其分子各個(gè)軸向的差異并不大，因此，公式(2)可以用來估算RH的合理近似值。

以金納米顆粒為例，納米顆粒在材料、物理、電氣工程和生物醫(yī)學(xué)工程等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用，其大小和納米顆粒的表面化學(xué)性質(zhì)是兩個(gè)關(guān)鍵參數(shù)。通常，納米粒子的大小由電子顯微鏡確定，表面化學(xué)性質(zhì)利用光譜學(xué)來表征，例如紅外和拉曼光譜。Yarger課題組[93]利用DOSY等核磁共振波譜對金納米顆粒的尺寸、表面化學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，為納米顆粒的尺寸測定和表面化學(xué)研究建立了更先進(jìn)、便捷的方法。值得注意的是：通過擴(kuò)散系數(shù)定量的納米顆粒尺寸，往往與透射電鏡測量的尺寸有差異，且比電鏡測量尺寸稍大。這是因?yàn)殡婄R主要專注于測量金屬核的物理尺寸，而DOSY則考慮了與納米顆粒表面結(jié)合的配體，測量對象是溶液中粒子的有效水合直徑。

2.3 分子量Mw

DOSY可用于測定聚合物[58]、多糖[48]、蛋白質(zhì)[96]等的分子量分布，依據(jù)所使用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，大致可分為內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法兩種。外標(biāo)法需選擇合適的參考物質(zhì)，通常是結(jié)構(gòu)與待測物相似的已知化合物。首先測量出參考化合物擴(kuò)散系數(shù)D與分子量Mw的雙對數(shù)關(guān)系圖。然后在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，測量未知化合物的D值，將其帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，推導(dǎo)出未知化合物的分子量Mw。Li等[47]通過DOSY實(shí)驗(yàn)測定了各種活性/受控聚合過程生產(chǎn)的聚合物的平均Mw。采用外標(biāo)法，利用已知窄分散聚苯乙烯的logD和logMw，在3種常用受控聚合方法中準(zhǔn)確監(jiān)控聚合過程，測試結(jié)果與凝膠滲透色譜法(GPC)數(shù)據(jù)高度吻合。Stalke等提出了一種新穎的DOSY測試分子量的方法[51-53]，基于具有歸一化D的外部校準(zhǔn)曲線(ECC)，進(jìn)行分子量測定。研究人員提供了31種小分子模型，分子量Mw范圍為70～600 g/mol，可根據(jù)待分析物的分子形狀(緊湊球形、耗散球形、橢圓形、圓盤形)選擇相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

內(nèi)標(biāo)法是向待分析物樣品中添加內(nèi)部參比物，以獲得內(nèi)部校準(zhǔn)曲線(ICC)[49]。該方法需要惰性的內(nèi)部參考物質(zhì)，參考物質(zhì)應(yīng)具有理想的分子量分布，并且信號(hào)與溶液中的其他組分不重疊。李紅衛(wèi)等[96]以3-(三甲基硅基)丙磺酸鈉(DSS)為內(nèi)標(biāo)，通過蛋白質(zhì)分子與DSS 自擴(kuò)散系數(shù)的比值(Dr)來表征蛋白質(zhì)分子在溶液中的表觀分子量，有效地降低了儀器、樣品濃度、緩沖體系的影響。

2.4 分子間締合常數(shù)Ka

基于NMR的化學(xué)位移滴定法是確定締合常數(shù)Ka的有力工具，被廣泛用來量化多組分系統(tǒng)中分子間的相互作用[44]。在某些情況下，化學(xué)位移滴定法容易將酸堿化學(xué)反應(yīng)與分子間的結(jié)合過程相混淆。相比之下，質(zhì)子轉(zhuǎn)移對DOSY的影響微不足道，因此DOSY可以作為化學(xué)位移滴定法的有效補(bǔ)充[56-57]，減小由此帶來的誤差。但DOSY測量締合常數(shù)有局限性，通常只能確定10～105L/mol范圍內(nèi)的Ka。1>∶1配比的主客體復(fù)合物(HG)，其主客體之間的Ka可以通過公式(3)來計(jì)算。[H]、[G]、[HG]分別是體系平衡時(shí)主體、客體、主-客體復(fù)合物的濃度：

Ka=[HG]/[H][G]

(3)

Guella等通過DOSY研究了香蘭素的自聚集以及與β-環(huán)糊精的絡(luò)合平衡[37]。香蘭素在水中的自締合常數(shù)很低(Ksa=(9.8±0.7 )L/mol)，表明其以游離和少量低聚物的形式存在。對于β-環(huán)糊精水溶液，DOSY沒有檢測到任何聚集現(xiàn)象。改變香蘭素/β-環(huán)糊精混合物的濃度(2～15 mmol/L)，得到的香蘭素/β-環(huán)糊精絡(luò)合常數(shù)(Ka)比香蘭素自聚集Ksa高一個(gè)數(shù)量級，從(86±7 )L/mol增加到(142±9 )L/mol，且呈現(xiàn)非單調(diào)變化趨勢，表明Ka實(shí)際上是一個(gè)“表觀”平衡常數(shù)。證明除了(1>∶1)香蘭素/β-環(huán)糊精絡(luò)合物之外，還存在其他締合絡(luò)合物，例如(香蘭素)2和(香蘭素/β-環(huán)糊精)2。

3 結(jié)論與展望

DOSY可以通過測量混合物的擴(kuò)散系數(shù)，分離鑒別混合物組成，提供分子尺寸、分子量、分子間相互作用及聚集狀態(tài)的具體信息，已成為研究化學(xué)和生物系統(tǒng)中分子擴(kuò)散的首選方法。隨著混合物體系復(fù)雜程度的增加，DOSY的分辨能力及靈敏度是制約未來擴(kuò)大其應(yīng)用范圍的關(guān)鍵所在。儀器和軟件的快速發(fā)展，例如超高磁場磁體(1.2 GHz)、高靈敏度超低溫探頭、快速2D脈沖序列的出現(xiàn)，將使DOSY實(shí)驗(yàn)更加準(zhǔn)確和高效。除此之外，波譜學(xué)家們也在嘗試通過增加譜圖維度、優(yōu)化分離算法、添加基質(zhì)調(diào)控?cái)U(kuò)散系數(shù)等手段[38]，不斷擴(kuò)大DOSY的應(yīng)用范圍。綜上所述，DOSY實(shí)驗(yàn)未來會(huì)越來越成熟，可為研究者提供可靠、高效的混合物表征手段。