張彥濤 褚智杰 孫君軍 劉偉峰 楊成 楊延輝

1河南科技大學臨床醫(yī)學院，洛陽471003；2河南科技大學第一附屬醫(yī)院肝膽外科，洛陽471003

0 引言

原發(fā)性肝癌是一種難以根治的惡性腫瘤，其具有高發(fā)病率、高死亡率的特點[1]，其中90%以上為肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）。流行病學證據(jù)表明，HCC的發(fā)病率以及死亡率逐年上升[2-3]，其病死率高居惡性腫瘤的第2位[4-5]。隨著對HCC研究的不斷深入，人們對HCC的定期篩查越來越重視，此外隨著手術(shù)水平的提升，放療、化療藥物的進步，及介入、靶向治療等精準化治療技術(shù)的發(fā)展，HCC患者的生存時間和生存質(zhì)量已有了一定的改善。但目前，對HCC的治療仍有較大瓶頸，患者術(shù)后的5年生存率仍令人不甚滿意[6]。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ(microtubule-associated protein I light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ)是表征細胞自噬的標志物，其可以反映細胞自噬水平的高低。在很多腫瘤細胞中，自噬基因都發(fā)生了表達減少、表達增加、突變等變異，而在細胞自噬的調(diào)控過程中，許多癌基因、致癌途徑和腫瘤抑制基因都充當了重要角色[6-7]。激活轉(zhuǎn)錄因子3（activating transcription factor 3，ATF3）是 ATF/CREB轉(zhuǎn)錄因子家族成員，其可通過啟動或關(guān)閉靶基因的轉(zhuǎn)錄，對細胞凋亡、周期進展及腫瘤的發(fā)生發(fā)展進行調(diào)控。目前主流的學術(shù)觀點認為，LC3-Ⅱ、ATF3在腫瘤發(fā)生過程中均發(fā)揮雙重作用，一方面可以促進腫瘤細胞生長，另一方面可以抑制腫瘤細胞形成。

目前，鮮有研究涉及基于LC3-Ⅱ、ATF3的聯(lián)合檢測，分析其在HCC中的作用機制。本研究中，分析9例新鮮HCC組織和癌旁組織，回顧性分析82例HCC組織和癌旁組織蠟塊標本。通過Western blot和免疫組化法檢測樣本LC3-Ⅱ和ATF3的表達，探究其表達水平與HCC患者臨床病理學特征及預后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2011年1月至2014年10月，河南科技大學第一附屬醫(yī)院肝膽外科收治的經(jīng)手術(shù)治療的HCC患者82例；其中，男性68例，女性14例，年齡（54.3±8.5）歲；收集相關(guān)的HCC組織和癌旁組織蠟塊標本。選擇2018年11月至2019年3月，河南科技大學第一附屬醫(yī)院肝膽外科收治的經(jīng)手術(shù)治療的HCC患者9例；其中，男性5例，女性4例，年齡（53.9±4.5）歲；收集相關(guān)的HCC組織和距腫瘤組織＞3 cm的癌旁組織樣本，9例新鮮組織樣本均于離體后30 min內(nèi)用生理鹽水沖洗凈、無菌紗布蘸干，錫箔紙包裹后置于液氮罐中快速冷凍，24 h后置于-80℃冰箱內(nèi)保存。收集患者的一般臨床病理資料，包括患者年齡、性別、血清甲胎蛋白（alphafetoprotein，AFP）、腫瘤分化程度、靜脈癌栓、腫瘤直徑、HBsAg等。

所有病例均經(jīng)過臨床病理證實，并具有完整病例資料和隨訪資料。所有病例患者在術(shù)前沒有經(jīng)過任何抗腫瘤治療。本研究已通過河南科技大學第一附屬醫(yī)院倫理審查委員會的批準。

1.2 主要材料與儀器

羊抗兔二抗、二辛可寧酸（bicinchoninincacid，BCA）蛋白定量試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfonate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液（5×）、N，N，N＇，N＇-四甲基乙二胺（N，N，N＇，N＇-Tetramethylethylenediamine，TEMED）、預染蛋白 Marker、聚偏氟乙烯(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜、電化學發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）顯色試劑盒、放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液、非磷酸化蛋白酶抑制劑（北京康為世紀生物科技有限公司）；兔/鼠通用型鏈霉親和素（Streptavidin，SP）試劑盒、聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯（Tween-20）（北京索萊寶科技有限公司），ATF3兔單克隆抗體（英國Abcam公司），LC3-Ⅱ兔單克隆抗體、抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔單克隆抗體（美國 CST公司）。

-80℃冰箱、-20℃冰箱、高壓滅菌鍋、多功能酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），光學顯微鏡（日本NIKON公司），RM2235型石蠟切片機（德國Leica公司），渦旋振蕩器、冷凍離心機（德國Eppendorf公司），普通離心機、Western blot電泳槽、轉(zhuǎn)膜槽、凝膠成像系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司）。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學染色

病理組織蠟塊經(jīng)切片、烤片、脫蠟、水化等步驟后后，加入檸檬酸修復液進行高壓鍋抗原修復；自然冷卻后，在室溫條件下用過氧化氫封閉10 min，山羊封閉血清作用10 min，甩去羊血清后滴加一抗（1∶500稀釋）孵育3 h，回收一抗后磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌 3 次；加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗室溫孵育30 min，PBS洗滌 3次（3 min/次）；3，3'-二氨聯(lián)苯胺（3，3'-diamiobenzidine，DAB）顯色，蘇木素染色，0.1%HCl分化；95%乙醇溶液洗2次（5 min/次），無水乙醇洗3次（5 min/次），二甲苯洗 3次（5 min/次），進行脫水；中性樹膠封片鏡檢[8]。

依照陽性細胞及強度進行陽性與陰性評定。采用雙盲法在低倍鏡下觀察切片，分別在腫瘤細胞及癌旁組織細胞切片上隨機選取5個高倍視野（×400），每個視野計數(shù)100個細胞，陽性細胞率（%）=（陽性細胞數(shù)／觀察細胞數(shù)）×100%。LC3-Ⅱ的陽性表現(xiàn)為細胞質(zhì)或細胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒。ATF3的陽性表現(xiàn)為細胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒，細胞質(zhì)表達而細胞核不表達者為陰性。陽性細胞分級標準為：陽性細胞率≤10%為1分，11%～50%為2分，＞50%為3分。染色強度分級標準為：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項評分的乘積＞3分為高表達，≤3分為低表達[9-10]。

1.3.2 Western blot

適量液氮預冷無菌研缽及研磨杵后，取-80℃冰箱凍存的標本50 mg迅速放入研缽中，繼續(xù)加適量液氮將組織研磨成細粉末狀；將組織轉(zhuǎn)入1.5 ml無菌無酶的離心管中，按每克組織加10 ml的比例加入RIPA裂解液（含非磷酸化蛋白酶抑制劑），置于冰上裂解 0.5～1 h（期間震蕩 4～6 次，每次 1 min）；4℃下，以12 000 r/min離心20 min，取上清并轉(zhuǎn)入新的無菌無酶離心管中（蛋白存在于上清液中）；用BCA定量法測定蛋白濃度，制備濃度相等的蛋白樣品（100℃水浴鍋加熱10 min使蛋白變性防止降解）；制備12%凝膠，加入制備好的電泳液進行電泳，低溫下轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF膜（0.22 μm）1 h；TBST 洗膜，加入一抗 4℃過夜，其中LC3-Ⅱ、ATF3、GAPDH 均為 1∶1 000 稀釋；次日室溫復溫1 h，TBST洗膜3次（10 min/次）；室溫下加入二抗孵育 2 h，TBST洗膜 3次（10 min/次）；配置 ECL顯色液（A液、B液按1∶1比例配置）；使用凝膠成像系統(tǒng)進行曝光，檢測目的蛋白條帶。利用ImageJ軟件檢測蛋白條帶灰度值并進行定量分析，目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值即為目的蛋白的相對表達量[8,11]。

1.4 統(tǒng)計學方法

利用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)。LC3-Ⅱ、ATF3在HCC組織中的表達和臨床病理學參數(shù)之間的關(guān)系采用χ2檢驗；LC3-Ⅱ、ATF3兩者表達的相關(guān)性分析，采用Pearson相關(guān)分析；用Kaplan-Meier法繪制生存曲線。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學染色結(jié)果

免疫組織化學結(jié)果表明：LC3-Ⅱ主要定位于細胞漿或細胞膜，染色呈棕黃色；ATF3主要定位于細胞核，染色呈棕黃色；LC3-Ⅱ、ATF3在HCC組織中低表達或不表達。（圖1）

2.2 Western blot結(jié)果

結(jié)果顯示，HCC組織、癌旁組織中均能檢測到LC3-Ⅱ和ATF3的表達，其在癌旁組織中的表達均高于HCC組織（圖2）。定量分析結(jié)果顯示，LC3-Ⅱ、ATF3在癌旁組織中的表達明顯高于HCC組織，且差異均具有統(tǒng)計學意義（圖3）。

2.3 LC3-Ⅱ、ATF3的表達與HCC臨床病理特征的關(guān)系

HCC組織中LC3-Ⅱ、ATF3的表達水平不僅與腫瘤分化程度有關(guān)（均P＜0.05），也與是否合并靜脈癌栓有關(guān)（均P＜0.05），而與患者年齡、性別、血清AFP、腫瘤直徑、HBsAg等無明顯相關(guān)性（均P＞0.05）。（表1）

2.4 LC3-Ⅱ和ATF3在HCC組織中表達的相關(guān)性分析

對9例新鮮HCC組織中LC3-Ⅱ、ATF3的表達情況進行Western blot定量分析。結(jié)果表明，LC3-Ⅱ、ATF3的表達在HCC組織中的變化趨勢一致。Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，在HCC組織中，LC3-Ⅱ和ATF3的表達密切相關(guān)，且為正相關(guān)的趨勢（r=0.621，P＜0.001）。

圖1 肝細胞癌組織中LC3-Ⅱ和ATF3蛋白表達的免疫組化染色圖像

2.5 LC3-Ⅱ和ATF3對HCC患者生存期的影響

Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示，LC3-Ⅱ高表達患者的生存期為（45.57±5.63）月，明顯長于低表達者的（36．95±2．69）月，且預后更好（χ2=4.67，P=0.031）；ATF3高表達患者的生存期為（47.40±5.72）月，明顯長于低表達者的（34．75±2．85）月，且預后更好（χ2=8．14，P=0.004）；LC3-Ⅱ、ATF3 同時高表達患者的生存期為（57．67±5．62）月，明顯長于其他患者（36.64±2.57）月，且預后更好（χ2=12.47，P＜0.001）。（圖 4）

圖2 肝細胞癌組織及癌旁組織中LC3-Ⅱ和ATF3的Western blot結(jié)果

圖3 肝細胞癌組織及癌旁組織中LC3-Ⅱ和ATF3蛋白相對表達量

表1 LC3-Ⅱ、ATF3蛋白表達與肝細胞癌臨床病理特征的相關(guān)性

3 討論與結(jié)論

目前，手術(shù)治療仍為治療HCC的第一選擇[12-13]，但臨床上僅有不足30%的原發(fā)性肝癌患者可以接受手術(shù)治療[12]，且手術(shù)整體切除率低、復發(fā)率高[14]，導致HCC的預后很不理想[15-17]。有條件的患者可以選擇進行肝移植，不能手術(shù)的早期患者也可以選擇放療、化療、介入治療和靶向治療[18-21]。目前，HCC發(fā)生發(fā)展的具體分子機制仍不明晰，極大地限制了HCC的治療。因此，探索HCC發(fā)生發(fā)展所涉及的分子機制，對于改善HCC的治療有重要意義，同時也可為HCC的生物學預防提供依據(jù)。

圖4 肝細胞癌患者的Kaplan-Meier生存曲線與LC3-Ⅱ和ATF3表達的關(guān)系

本研究中，使用Western blot和免疫組化方法檢測9例新鮮的HCC組織和對應的癌旁組織，以及82例HCC和對應的癌旁組織蠟塊標本中的LC3-Ⅱ和ATF3的表達情況。結(jié)果顯示，LC3-Ⅱ和ATF3在HCC組織中的表達顯表達顯著低于癌旁組織。進一步分析LC3-Ⅱ和ATF3的表達與HCC患者臨床特征之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)LC3-Ⅱ和ATF3的表達與腫瘤分化程度、靜脈侵襲情況密切相關(guān)（均P＜0.05）。通過對HCC患者的隨訪資料進行分析，發(fā)現(xiàn)LC3-Ⅱ和ATF3的表達水平與HCC患者的預后密切相關(guān)。因此，可以認為LC3-Ⅱ和ATF3聯(lián)合檢測可作為HCC惡性程度評估的重要指標，且有助于判斷HCC患者的預后；LC3-Ⅱ和ATF3有望成為HCC治療的重要靶點。

本研究的結(jié)果提示，LC3-Ⅱ和ATF3在HCC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，但具體機制仍需進一步探究。LC3-Ⅱ是公認的反映細胞自噬水平的標志物[22-23]。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，自噬所發(fā)揮的作用是雙向性的，一方面，通過過度激活自噬死亡途徑的方式，自噬可以清理掉一部分已經(jīng)產(chǎn)生的腫瘤細胞；另一方面，腫瘤細胞在面對嚴苛的外部環(huán)境時，如缺血、缺氧、代謝障礙、營養(yǎng)和生長因子匱乏、抗腫瘤治療等，可以通過激活自噬獲得能量和營養(yǎng)物質(zhì)維持自身的生存，并減少細胞的凋亡，提高其抗應激能力[24-27]。在癌癥的發(fā)生和發(fā)展進程中，自噬發(fā)揮著舉足輕重的作用，隨著細胞外環(huán)境的變化，自噬在腫瘤發(fā)生過程中所發(fā)揮的作用也不斷變化[28-30]。ATF3屬于應激相關(guān)基因，在細胞靜止狀態(tài)下，ATF3的表達處于低表達的穩(wěn)態(tài)，但當出現(xiàn)應激信號時，ATF3基因可迅速作出反應，并通過多種途徑促進ATF3表達。有研究結(jié)果顯示，高表達的ATF3可以促進HeLa細胞存活[31]。然而，也有體外細胞實驗結(jié)果表明，高表達的ATF3能夠顯著抑制食管癌細胞的增殖，即當ATF3處于高水平表達時，腫瘤細胞的成瘤能力受到了明顯的抑制[32]。這些研究結(jié)果均提示LC3-Ⅱ和ATF3在HCC發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，進而影響HCC進展。

LC3-Ⅱ和ATF3在其他惡性腫瘤中已經(jīng)被廣泛研究。有研究者對Salinomycin誘導細胞自噬的分子機制進行了研究，發(fā)現(xiàn)Salinomycin誘導細胞自噬的關(guān)鍵在于抑制ATF4-DDIT3/CHOP-TRIB3-AKT1-MTOR通路，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在其中扮演了負性調(diào)節(jié)因子的角色[33-34]。在前列腺癌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通路中，ATF4/ATF3/CHOP軸參與調(diào)控細胞凋亡[35-37]，此外在前列腺癌中，ATF4-DDIT3/CHOP-TRIB3-AKT1-MTOR通路也參與調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘發(fā)的自噬，兩條通路具有共同的下游因子CHOP。該結(jié)果再次提示LC3-Ⅱ和ATF3在調(diào)控腫瘤進展的過程中關(guān)系密切。

本研究結(jié)果表明，LC3-Ⅱ和ATF3在HCC組織中呈低表達狀態(tài)；LC3-Ⅱ和ATF3的表達與HCC組織的分化程度及靜脈侵襲密切相關(guān)（均P＜0.05），而與年齡、性別、血清AFP、腫瘤直徑、HBsAg等無明顯相關(guān)性（均P＞0.05）；LC3-Ⅱ和ATF3高表達的患者生存率明顯高于低表達者（P＜0.05）。此外，LC3-Ⅱ和ATF3在HCC組織中的表達正相關(guān)，提示兩者在HCC的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮著相輔相成的作用。當然，該結(jié)果需要一系列的細胞實驗和動物實驗進行驗證。

綜上所述，LC3-Ⅱ和ATF3很可能在HCC的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要的協(xié)同作用，有望成為評估HCC惡性程度及預測HCC預后的重要指標，并有望成為HCC的潛在治療靶點。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突