李伯全 康勝虎 王蕊

中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第983醫(yī)院泌尿外科，天津300142

0 引言

腎細(xì)胞癌（腎癌）是常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，其約占成人癌癥病例的3%[1-2]。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，每年約有20.9萬(wàn)新發(fā)腎癌病例和10.2萬(wàn)因腎癌死亡病例[3]，其中初診即被診斷為轉(zhuǎn)移性腎癌的患者約占30%。一旦腎癌進(jìn)入轉(zhuǎn)移期，其治療就非常困難，因此這類(lèi)患者的5年生存率普遍較低[4-5]。

腎透明細(xì)胞癌約占所有腎癌的80%，其對(duì)放射治療（放療）和化學(xué)治療（化療）均不敏感[6]，手術(shù)治療仍然是其主要治療手段，但手術(shù)后的復(fù)發(fā)率約33%[7]。因此，有必要針對(duì)腎透明細(xì)胞癌的基因靶點(diǎn)展開(kāi)研究，以便為腎透明細(xì)胞癌的靶向治療提供依據(jù)。

細(xì)胞周期蛋白 B2（cyclin B2，CCNB2）與 CCNB1均為細(xì)胞周期蛋白B族的重要成員，在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期方面發(fā)揮重要作用[8]。CCNB1和CCNB2在不同分裂期細(xì)胞定位方面存在很大差異：在分裂間期，CCNB1定位于微粒體，CCNB2則定位于高爾基體；在分裂期，CCNB1定位于細(xì)胞核，CCNB2則分散在細(xì)胞中[9-10]。多項(xiàng)研究結(jié)果表明，CCNB2參與腫瘤的進(jìn)展。因此，對(duì)CCNB2開(kāi)展研究有望揭示腫瘤發(fā)病的一些分子機(jī)制[11]。CCNB2參與很多腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，如非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌等[11-12]，其中患者的CCNB2表達(dá)水平明顯升高[13-14]。

目前，關(guān)于CCNB2在腎透明細(xì)胞癌發(fā)展中的相關(guān)功能和分子機(jī)制的研究較少，本研究中主要研究腎透明細(xì)胞癌患者CCNB2的mRNA在腫瘤組織與癌旁正常組織中的表達(dá)，分析CCNB2與腎透明細(xì)胞癌患者的臨床病理特征之間的關(guān)系，并研究CCNB2蛋白表達(dá)水平與腎透明細(xì)胞癌患者的預(yù)后生存之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2010年10月至2019年12月，中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第983醫(yī)院泌尿外科收治的經(jīng)手術(shù)治療的腎透明細(xì)胞癌患者98例。其中，男性54例，女性44例，年齡（53.2±9.8）歲。全部病例均經(jīng)過(guò)臨床病理證實(shí)，并具有完整的病例資料。收集患者的腫瘤組織和相應(yīng)的癌旁正常組織樣本。臨床病理特征包括患者性別、年齡、腫瘤分期、腫瘤分級(jí)、腫瘤大小。根據(jù)AJCC-TNM-2010分類(lèi)系統(tǒng)和WHO/ISUP-2016系統(tǒng)分別評(píng)估腫瘤分期和分級(jí)[15-16]。本研究以1964年赫爾辛基宣言和隨后所有修訂案中規(guī)定的道德標(biāo)準(zhǔn)為基礎(chǔ)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 主要材料與儀器

山羊血清封閉液、免疫組化二抗試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），3，3'-二氨基聯(lián)苯胺（3，3'-diaminobenzidine，DAB）（美國(guó) Cell Signaling Technology公司）。

RM2235型石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica公司），BX51型顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

所有的組織切片經(jīng)福爾馬林固定，石蠟包埋，4℃切片保存。將組織切片放入60℃的烘箱中30 min；然后將切片先后浸入二甲苯罐處理3次，每次10 min；梯度乙醇溶液水化處理5次，每次5 min；將處理過(guò)的切片用蒸餾水沖洗5 min，然后用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌 5 min，重復(fù)2次；將切片浸泡在體積分?jǐn)?shù)為3%的H2O2溶液中10 min；PBS洗滌3次；將切片放入修復(fù)液，煮沸至120℃，5 min后冷卻至室溫，以修復(fù)抗原；將山羊血清滴加到組織塊上，室溫封閉50 min；根據(jù)切片上組織的大小加入一抗，室溫孵育1 h；PBS洗滌4次，每次5 min；吸取適量二抗滴加于組織切片上，孵育40 min；PBS洗滌4次，每次5 min；滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶（streptavidin-perosidase，SP）后，孵育 40 min；PBS 沖洗 4 次，每次 5 min；滴加DAB顯色液，顯色3 min，沖洗，并用適量蘇木精復(fù)染；將組織切片用梯度乙醇溶液處理（80%、11 s，90%、11 s，100%、6 min、100%、6 min）；將切片浸入二甲苯中處理3次，每次5 min；用中性樹(shù)膠進(jìn)行封片，晾干；用顯微鏡觀察并采集圖像。

組織中出現(xiàn)棕黃色顆粒，則認(rèn)為該組織為陽(yáng)性染色，隨機(jī)選取5個(gè)不同的視野，依照陽(yáng)性細(xì)胞著色面積及強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)定。陽(yáng)性細(xì)胞著色面積評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞著色面積＜10%，記0分；著色面積在10%～25%時(shí)，記1分；著色面積在26%～75%時(shí)，記2分；著色面積＞75%時(shí)，記3分。陽(yáng)性染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陰性染色記0分；弱陽(yáng)性染色記1分；中陽(yáng)性染色記2分；強(qiáng)陽(yáng)性染色記3分。以陽(yáng)性細(xì)胞著色面積評(píng)分和染色強(qiáng)度評(píng)分之和判斷表達(dá)情況，結(jié)果＜5分，為低表達(dá)；結(jié)果≥5分，為高表達(dá)。

1.2.3 臨床樣本生物信息學(xué)分析

通過(guò)基因表達(dá)譜交互分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）數(shù)據(jù)庫(kù)獲取臨床樣本615例，其中包括515例腎透明細(xì)胞癌組織樣本和100例癌旁正常組織樣本。通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析CCNB2的mRNA在腎透明細(xì)胞癌組織和癌旁正常組織中的差異。數(shù)據(jù)庫(kù)的網(wǎng)址為http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php?gene=CCNB2。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示；組間比較采用學(xué)生t檢驗(yàn)；利用χ2檢驗(yàn)分析臨床病理特征與蛋白表達(dá)的關(guān)系；生存分析采用Kaplan-Meier法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析結(jié)果

為了更好地闡明CCNB2在腎透明細(xì)胞癌組織中的作用，通過(guò)GPEIA分析CCNB2的mRNA在腎透明細(xì)胞癌組織和正常組織中的表達(dá)情況，共分析腎透明細(xì)胞癌組織515例及正常組織100例。結(jié)果表明，CCNB2的mRNA在腎透明細(xì)胞癌組織中顯著高表達(dá)（圖1），表明CCNB2參與腎透明細(xì)胞癌的發(fā)展。為了進(jìn)一步研究CCNB2的表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌患者長(zhǎng)期預(yù)后的關(guān)系，利用Kaplan-Meier曲線分析了CCNB2在腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后中的作用。結(jié)果表明，CCNB2表達(dá)較低的患者中，總生存率和無(wú)病生存率都較高（圖2A和圖2B）。結(jié)果提示，CCNB2的表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌患者的生存期具有顯著的相關(guān)性，提示CCNB2的異常表達(dá)可能與腎透明細(xì)胞癌患者的不良預(yù)后相關(guān)（圖2）。

2.2 CCNB2在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，CCNB2在腎透明細(xì)胞癌組織中高表達(dá)（圖3A），而在癌旁正常組織中CCNB2的表達(dá)顯著降低（圖3B），這表明CCNB2可能影響腎透明細(xì)胞癌的生長(zhǎng)和發(fā)展。根據(jù)染色強(qiáng)度，將腎透明細(xì)胞癌患者分為CCNB2高表達(dá)組和CCNB2低表達(dá)組。

2.3 CCNB2蛋白表達(dá)水平與腎透明細(xì)胞癌患者的臨床病理特征的相關(guān)性

為了闡明CCNB2在腎透明細(xì)胞癌進(jìn)展中的作用，分析比較了CCNB2高表達(dá)組和CCNB2低表達(dá)組患者的臨床病理特征差異，包括年齡、性別、腫瘤分期、腫瘤分化程度、腫瘤體積。分析結(jié)果表明，CCNB2表達(dá)水平與腫瘤分期（P=0.039）和腫瘤大?。≒=0.001）顯著相關(guān)，而與年齡（P＞0.05）、性別（P＞0.05）、腫瘤分級(jí)（P＞0.05）的相關(guān)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（表 1）

3 討論

腎細(xì)胞癌僅次于膀胱癌，是發(fā)病率第二位的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，其中80%以上病例為腎透明細(xì)胞癌[17-18]。目前，手術(shù)作為腎透明細(xì)胞癌的主要治療手段，其復(fù)發(fā)率高，且存在很大的局限性。因此，為了開(kāi)展針對(duì)腎透明細(xì)胞癌的靶向治療，有必要進(jìn)對(duì)腎透明細(xì)胞癌的相關(guān)作用蛋白展開(kāi)研究[19-20]。

圖1 腎透明細(xì)胞癌組織中細(xì)胞周期蛋白B2（CCNB2）的mRNA表達(dá)

圖2 細(xì)胞周期蛋白B2表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌患者生存率的相關(guān)性

圖3 腎透明細(xì)胞癌組織和癌旁正常組織中CCNB2的免疫組化結(jié)果

表1 CCNB2蛋白表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌患者臨床病理特征的相關(guān)性分析

CCNB1主要通過(guò)G2/M過(guò)渡發(fā)揮作用，其通過(guò)觸發(fā)蛋白質(zhì)磷酸化來(lái)調(diào)控有絲分裂早期活動(dòng)，還可通過(guò)調(diào)節(jié)染色體分離酶的活動(dòng)在有絲分裂后期發(fā)揮作用[21-22]。而CCNB2參與多種腫瘤的發(fā)展進(jìn)程，在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等多種癌癥中有重要作用[23-24]。但目前，CCNB2在腎透明細(xì)胞癌中的作用機(jī)制及臨床預(yù)后等方面尚不清楚。本研究中，通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析了515例腎透明細(xì)胞癌組織樣本和100例癌旁正常組織樣本。結(jié)果表明，與癌旁正常組織相比，腎透明細(xì)胞癌組織CCNB2的mRNA表達(dá)水平明顯升高。

Shubbar等[25]的研究結(jié)果表明CCNB2表達(dá)水平越高，乳腺癌患者的生存期越短，且通過(guò)多因素分析證實(shí)了胞漿中CCNB2蛋白表達(dá)水平是患者生存期的獨(dú)立預(yù)后因素。Takashima等[11]則發(fā)現(xiàn)肺癌患者的生存期與CCNB2的mRNA表達(dá)水平呈明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系。本研究的結(jié)果顯示，對(duì)于腎透明細(xì)胞癌患者，CCNB2表達(dá)程度越高，其總生存率和無(wú)病生存率越低。

對(duì)CCNB2蛋白與腎透明細(xì)胞癌患者的臨床病理特征的分析結(jié)果表明，CCNB2表達(dá)水平與腫瘤分期、腫瘤大小顯著相關(guān)（均P＜0.05），但與性別、年齡、腫瘤分級(jí)無(wú)關(guān)（均P＞0.05）。提示可采用CCNB2表達(dá)量來(lái)預(yù)測(cè)腫瘤的惡性程度。

綜上，CCNB2參與腎透明細(xì)胞癌的發(fā)展進(jìn)程，且在腫瘤發(fā)展中扮演十分重要的作用。CCNB2高表達(dá)，則預(yù)示腎透明細(xì)胞癌患者的不良預(yù)后，且其與腫瘤分期、腫瘤大小有關(guān)?？梢哉J(rèn)為，CCNB2有望成為腎透明細(xì)胞癌診斷、治療及預(yù)后的潛在靶點(diǎn)。下一步，將通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)深入探討CCNB2在腎透明細(xì)胞癌發(fā)展、轉(zhuǎn)移等方面的分子機(jī)制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突