李冰濤 劉現(xiàn)立

1河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院，洛陽(yáng)471003；2河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸外科，洛陽(yáng)471003

0 引言

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是一種高發(fā)的消化道惡性腫瘤。在我國(guó)，CRC的發(fā)病率位居所有惡性腫瘤中的第3位，僅次于肺癌和胃癌，其死亡率位居惡性腫瘤死亡率的第5位[1]。早期CRC患者難以被有效發(fā)現(xiàn)，約有25%的CRC患者在確診時(shí)已經(jīng)發(fā)生了癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[2]。癌細(xì)胞擴(kuò)散與轉(zhuǎn)移對(duì)患者的預(yù)后有重要影響，隨著癌細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)與擴(kuò)散，腫瘤惡性程度不斷加深，治愈難度加大，且預(yù)后較差[3]。目前，手術(shù)切除仍然是CRC的主要治療手段[4]，但手術(shù)聯(lián)合放療、化療的臨床效果仍不理想[5]。其中，奧沙利鉑、卡培他濱、5-FU等化療藥物副反應(yīng)較大，患者治療后的中位生存期（median survival time，MST）不足 2 年[6]。

目前，CRC的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，因此探究其發(fā)生與發(fā)展的機(jī)制，尋找新的治療途徑來(lái)抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移，對(duì)提高CRC患者的總體治療效果及預(yù)后生存期有十分重要的意義。近年來(lái)，靶向藥物在腫瘤治療方面日益發(fā)揮作用。CRC的靶向治療主要以表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）為主要靶點(diǎn)[7]，相關(guān)藥物包括西妥昔單抗和帕尼單抗[8-10]。但是，對(duì)于存在EGFR高表達(dá)的CRC患者，這些單克隆抗體藥物的有效率僅為20%左右，且容易產(chǎn)生耐藥性[11]。因此，為了提高CRC的靶向治療效果，需要尋找新的治療靶點(diǎn)。

組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶3（SET and MYND domaincontaining protein 3，SMYD3）是一種具有賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶功能的蛋白[12]，其結(jié)構(gòu)包括SET結(jié)構(gòu)域、MYND結(jié)構(gòu)域、SET-I結(jié)構(gòu)域、post-SET結(jié)構(gòu)域、C-末端結(jié)構(gòu)域（C-terminal domain，CTD）。其中，SET與MYND是重要的功能結(jié)構(gòu)域，SET結(jié)構(gòu)域可催化染色體組蛋白的賴氨酸殘基H3-K4，并使其甲基化進(jìn)而使染色體發(fā)生改變[13]；MYND是具有鋅指功能的結(jié)構(gòu)域，其能特定地與相關(guān)基因啟動(dòng)子序列結(jié)合，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，并增強(qiáng)轉(zhuǎn)移酶活性，影響細(xì)胞周期、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和下游與癌相關(guān)基因，使細(xì)胞的生物學(xué)特性發(fā)生改變，促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲，抑制細(xì)胞凋亡[14-16]。自從在人肝細(xì)胞癌和結(jié)腸癌中被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，SMYD3在腫瘤中的作用被廣泛研究[12]。SMYD3在食管鱗癌[17]、胃癌[18-19]、乳腺癌[20-21]、前列腺癌[22]和卵巢癌[23]等腫瘤組織中均高表達(dá)，且SMYD3高表達(dá)患者的預(yù)后較差。已有研究結(jié)果表明，SMYD3是CRC發(fā)生必不可少的基因[24]，且在胃癌患者中可作為獨(dú)立因素影響預(yù)后[25]。此外，抑制SMYD3可使上皮向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過程受阻，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲[26]。

本研究中，旨在分析SMYD3表達(dá)與直腸癌組織臨床病理的關(guān)系，分析其用于預(yù)后評(píng)價(jià)的價(jià)值，為SMYD3成為CRC治療的新靶點(diǎn)提供臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2012年3月至2013年6月河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的CRC直腸癌患者64例，其中男性39例、女性25例，年齡27～91歲，平均年齡（56.7±10.6）歲。所有患者均行手術(shù)切除治療，且經(jīng)病理證實(shí)為直腸癌。所有患者術(shù)前均未行放療或化療治療。采集患者的直腸癌組織（直腸癌組）和距腫瘤組織邊緣≥5 cm處的癌旁組織（對(duì)照組）。組織標(biāo)本離體后用福爾馬林固定，冷凍保存。

收集患者的一般臨床特征資料，包括性別、年齡、腫瘤分化程度、浸潤(rùn)程度、TNM（tumor-lymph node-metastasis）分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等。64例病例中，高、中、低分化分別為19例、35例、10例；浸潤(rùn)程度T1、T2為25例，T3、T4為39例；淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移28例，無(wú)轉(zhuǎn)移36例；TNM分期Ⅰ、Ⅱ期37例、Ⅲ、Ⅳ期27例。所有患者均簽署知情同意書，本研究已通過河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要材料與儀器

SMYD3兔抗人單克隆抗體（美國(guó)CST公司），二抗山羊抗兔LgG、放射免疫沉淀試驗(yàn)（radioimmunoprecipitation assay，RIPA） 裂解液、2,2′-聯(lián)喹啉-4,4′-二甲酸二鈉 （2,2′-Biquinoline-4,4′-dicarboxylic acid，BCA）蛋白定量試劑盒、ECL（electrochemiluminescence）顯色試劑盒、蛋白酶抑制劑混合物SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）（SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH） 兔抗體（英國(guó)Abcam公司），預(yù)染Maker（美國(guó)Thermo Fisher公司）。

RM2235型石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica公司），BX51型顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)SMYD3蛋白表達(dá)水平

直腸癌組織及癌旁組織樣本經(jīng)石蠟固定、包埋、切片后，放入烤箱，在60℃下持續(xù)烘烤1.5 h；放入二甲苯脫蠟、梯度乙醇溶液水化；微波爐檸檬酸抗原修復(fù)，置于室溫冷卻，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗 3 次，每次間隔3 min；使用過氧化物酶阻斷劑封閉，PBS沖洗3次，每次間隔3 min，血清封閉；在37℃下用SMYD3一抗孵育（按1∶100稀釋）3 h，之后用PBS沖洗5次，每次間隔3 min；在37℃下用二抗（山羊抗兔lgG）孵育1 h，PBS沖洗5次，每次間隔3 min；使用DAB試劑盒顯色，中止顯色后用蘇木素襯染，再次用梯度乙醇溶液脫水，二甲苯中透明；結(jié)束后用中性樹膠封片，并在顯微鏡下觀察拍照、評(píng)分。陰性對(duì)照中一抗用PBS代替。

結(jié)果由兩名資深病理科醫(yī)師協(xié)助觀察，結(jié)果取其平均值，若結(jié)果相差10%以上，則重新觀片。SMYD3以在細(xì)胞核染色出現(xiàn)黃色、棕黃色顆粒為陽(yáng)性，部分細(xì)胞質(zhì)也可表達(dá)呈淺黃色。在顯微鏡高倍視野（×400）下計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占總細(xì)胞數(shù)的百分比，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：≤10%為陰性，11%～25%為弱陽(yáng)性，26%～50%為陽(yáng)性，≥51%為強(qiáng)陽(yáng)性。將陰性與弱陽(yáng)性定為低表達(dá)，將陽(yáng)性與強(qiáng)陽(yáng)性定為高表達(dá)。

1.3.2 免疫蛋白印跡法（Western blot）檢測(cè)SMYD3蛋白表達(dá)水平

配制蛋白裂解液，其中RIPA裂解液、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、蛋白酶抑制劑的體積比為5 000∶50∶1。使用無(wú)菌的研缽將直腸癌組織及癌旁組織研磨成粉，將粉末刮下放入1.5 ml離心管中，每 500～1 000 mg組織中加入 500 μl配置好的蛋白裂解液，冰上裂解1～2 h，期間漩渦震蕩3～5次；在4℃下12 000 r/min離心20 min，取其上清進(jìn)行BCA蛋白定量，用10%SDS-PAGE進(jìn)行蛋白電泳，每孔加樣量為30 μg。使用甲醇激活聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜 1 min，低溫下轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h；封閉后，使用Tris緩沖鹽吐溫（tris Buffered saline Tween，TBST）緩沖液洗膜3次，每次5 min。

SMYD3兔單克隆抗體（1∶1 000）及內(nèi)參 GAPDH兔抗體（1∶2000）置于搖床之上，4℃下 60 r/min過夜孵育，TBST洗膜3次，每次5 min；山羊抗兔二抗（1∶2 000）室溫孵育 2 h；TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；將ECL顯影劑均勻涂在PVDF膜上，檢測(cè)目的蛋白條帶表達(dá)含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)（%）表示，采用卡方檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，采用 t檢驗(yàn)。應(yīng)用Kaplan-Meier繪制生存曲線，并進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn)生存時(shí)間之間的差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 直腸癌及癌旁組織中SMYD3蛋白的表達(dá)

免疫組化染色結(jié)果表明，SMYD3主要定位在細(xì)胞核，顯示為棕黃色、黃色顆粒，部分細(xì)胞質(zhì)也可陽(yáng)性著色呈淺黃色；直腸癌組織以強(qiáng)陽(yáng)性為主，癌旁組織以弱陽(yáng)性為主。直腸癌及癌旁組織中SMYD3的陽(yáng)性表達(dá)百分比分別為60.94%（39/64）、14.06%（9/64），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=30.00，P＜0.001）。（圖1）

2.2 SMYD3蛋白表達(dá)與直腸癌患者臨床病理特征的相關(guān)性分析

結(jié)果表明，直腸癌中SMYD3的表達(dá)水平與患者性別、年齡、分化程度無(wú)關(guān)（均P＞0.05），但與腫瘤TNM分期、浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（均P＜0.05）。有淋巴轉(zhuǎn)移的患者，其SMYD3蛋白高表達(dá)率高于無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移者（P＜0.05）。（表 1）

2.3 直腸癌及癌旁組織中SMYD3的mRNA表達(dá)

Western blot結(jié)果表明，直腸腺癌組織中SMYD3的表達(dá)量為（1.26±0.31），高于相應(yīng)的癌旁組織（0.55±0.22），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.95，P＜0.05）。（圖 2）

圖1 直腸癌組織和癌旁組織中組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶3（SMYD3）蛋白免疫組化染色圖片（×400）

表1 組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶3（SMYD3）蛋白表達(dá)與直腸癌患者臨床病理特征的相關(guān)性分析（n）

圖2 Western blot檢測(cè)直腸癌及癌旁組織中SMYD3蛋白的表達(dá)量

2.4 SMYD3表達(dá)水平與直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系

對(duì)64例直腸癌患者進(jìn)行跟蹤隨訪，起始時(shí)間為術(shù)后時(shí)間，結(jié)束時(shí)間為術(shù)后5年或患者死亡時(shí)間。根據(jù)隨訪數(shù)據(jù)繪制的Kaplan-Meier生存曲線如圖3所示。結(jié)果顯示，64例直腸癌患者在隨訪期的總生存率為61.38%。其中，SMYD3陰性表達(dá)者的生存率為80.17%，SMYD3陽(yáng)性表達(dá)者的生存率為45.98%；SMYD3陰性表達(dá)者的平均生存時(shí)間為（55.87±2.67）月，SMYD3陽(yáng)性表達(dá)者的平均生存時(shí)間為（44.53±2.72）月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.96，P＜0.05）。

圖3 直腸癌患者的Kaplan-Meier生存曲線

3 討論與結(jié)論

結(jié)直腸癌是一種嚴(yán)重影響我國(guó)居民健康的惡性消化道腫瘤，其發(fā)病率及死亡率逐年增高[27-28]。目前，手術(shù)、放療、化療仍是重要的結(jié)直腸癌治療手段，但由于結(jié)直腸癌發(fā)病部位的特殊性，這些治療手段不能使患者的生活質(zhì)量及預(yù)后達(dá)到理想效果。近年來(lái)，腫瘤靶向藥物治療廣受關(guān)注，但針對(duì)直腸癌靶向治療的相關(guān)研究較少。為了使直腸癌患者得到更好的治療，有必要尋找有效的腫瘤治療靶點(diǎn)，以便開展精準(zhǔn)、高效的治療。

本研究中，免疫組化染色和Western blot結(jié)果顯示，SMYD3在直腸癌組織中表達(dá)升高，明顯高于癌旁正常組織。通過分析直腸癌患者的SMYD3表達(dá)與其臨床病理特征關(guān)系，可知SMYD3表達(dá)與腫瘤TNM分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，與性別、年齡，及腫瘤分化程度無(wú)關(guān)。另外，隨訪結(jié)果顯示，SMYD3表達(dá)率較高的患者，其預(yù)后情況較差。上述結(jié)果提示，SMYD3在直腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。

近年來(lái)，關(guān)于SMYD3與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究較多。多項(xiàng)結(jié)果表明，SMYD3在多種腫瘤組織中表達(dá)升高，而在正常細(xì)胞組織中不表達(dá)或很少表達(dá)；SMYD3表達(dá)與腫瘤組織病理特征相關(guān)；SMYD3高表達(dá)患者的預(yù)后較差。肝癌組織中的SMYD3表達(dá)水平越高，其總生存期和無(wú)進(jìn)展生存期越短[26]。研究結(jié)果表明，在胃癌組織中SMYD3高表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期存在正相關(guān)[29-31]，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其可作為原發(fā)腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[25]。董尚文[32]在對(duì)143例食管鱗癌研究中發(fā)現(xiàn)，SMYD3的表達(dá)量在食管鱗癌組織中明顯高于正常組織，且其表達(dá)與患者術(shù)后總生存率相關(guān)，而且高表達(dá)預(yù)后差，表明SMYD3可作為低生存率患者的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[33]。同樣，SMYD3在乳腺癌組織中表達(dá)明顯高于正常組織，且腫瘤組織中SMYD3表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)[21，34]。此外，還發(fā)現(xiàn)對(duì)于SMYD3高表達(dá)的雌激素受體陽(yáng)性的乳腺癌患者，生存率明顯降低[35]。夏傳友等[36]證實(shí)，在前列腺癌組織中SMYD3表達(dá)明顯高于正常組織，且SMYD3定位于細(xì)胞核及胞漿，這與本研究中直腸癌細(xì)胞著色表達(dá)位置一致。有研究結(jié)果表明，伴隨著前列腺癌浸潤(rùn)程度的加深、Gleason評(píng)分逐漸增加，SMYD3表達(dá)隨之高，患者預(yù)后也越差，明確了SMYD3表達(dá)對(duì)手術(shù)治療的前列腺癌患者進(jìn)行臨床評(píng)估的重要意義[22]。此外，在惡性膠質(zhì)瘤中，SMYD3的表達(dá)與其病理等級(jí)相關(guān)，高表達(dá)患者的生存率降低[37]。

值得注意的是，有研究結(jié)果表明，食管鱗癌組織中SMYD3的表達(dá)與腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)[32]，在對(duì)乳腺癌的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果[34]。此外，還發(fā)現(xiàn)SMYD3表達(dá)與病理學(xué)分級(jí)、雌激素受體和孕激素受體等組間表達(dá)無(wú)關(guān)，但同HER-2陽(yáng)性表達(dá)正相關(guān)。上述結(jié)論與本研究中所得到的結(jié)果有所不同，推測(cè)產(chǎn)生這種情況可能是不同腫瘤細(xì)胞的不同生物學(xué)特征造成的，或者是由于樣本量差異由抽樣誤差所導(dǎo)致的。其確切的原因，需要進(jìn)一步的臨床研究和實(shí)驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)。

目前，關(guān)于SMYD3的致癌機(jī)制，研究者一致認(rèn)為組蛋白甲基化影響基因調(diào)控表達(dá)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展[24]。Hamamoto 等[20-21]證實(shí)，SMYD3可調(diào)控下游基因WNT10B表達(dá)，促使乳腺癌的發(fā)生；抑制或干擾SMYD3表達(dá)后，癌細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制、凋亡增加。有研究結(jié)果表明，食管鱗癌的發(fā)生是SMYD3通過調(diào)控RIZ1、EZR基因，誘發(fā)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)所導(dǎo)致的；在下調(diào)或干擾SMYD3表達(dá)后，可加快腫瘤細(xì)胞凋亡[33，38]。Sarris等[26]的研究結(jié)果表明，SMYD3可通過激活JAK/Stat3信號(hào)通路促進(jìn)誘發(fā)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換，促進(jìn)肝癌及結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，用siRNA技術(shù)可使SMYD3表達(dá)沉默，癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移受抑。在前列腺癌中，SMYD3轉(zhuǎn)錄調(diào)控雄激素受體（androgen receptor，AR），促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和侵襲，抑制凋亡[39-40]。BCI-121作為SMYD3抑制劑，可使H3K4me2/3甲基化水平降低，從而抑制肝癌、胰腺癌，結(jié)腸癌，前列腺癌和卵巢癌等增殖[41]，同樣可能對(duì)直腸癌也產(chǎn)生抑制。關(guān)于SMYD3是通過何種途徑調(diào)控基因表達(dá)最終促使直腸癌的發(fā)生發(fā)展，需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究中，采用免疫組化染色和Western blot得出SMYD3在人直腸癌組織中高表達(dá)，并與臨床病理特征相關(guān)。對(duì)患者的隨訪數(shù)據(jù)分析顯示，SMYD3高表達(dá)患者的預(yù)后較差。本研究結(jié)果表明，SMYD3參與直腸癌的發(fā)生發(fā)展，相關(guān)結(jié)果可為SMYD3作為直腸癌靶向治療的新靶點(diǎn)及預(yù)后預(yù)測(cè)因子提供基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突