吳婷婷 張星 馬英 李娟 李今 李華

1榆林市第一醫(yī)院新生兒科719000；2榆林市第一醫(yī)院PETCT中心719000；3西安市兒童醫(yī)院新生兒科710003；4西安市兒童醫(yī)院病理科710003；5西北婦女兒童醫(yī)院乳腺外科，西安710000；6西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院710000

0 引言

壞死性小腸結(jié)腸炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是臨床最常見的新生兒消化道疾病之一，不及時(shí)有效治療可引發(fā)感染性中毒、敗血癥、呼吸衰竭及腸穿孔，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致患兒死亡，對(duì)新生兒的生命與生存質(zhì)量均造成了嚴(yán)重影響[1-2]。目前，臨床對(duì)于NEC的主要治療原則為抗炎、改善腸道微循環(huán)及腸道菌群等，但尚無特效治療方法[3]。諸多研究結(jié)果表明，中藥及現(xiàn)代化中藥制劑對(duì)NEC具有較好療效。其中川芎嗪是一種臨床常用的中藥單體成分，主要提取自傘形科植物川芎根莖，具有抗炎、改善微循環(huán)、擴(kuò)張血管等多種藥理作用[4]。部分臨床研究結(jié)果顯示，川芎嗪對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎等腸道疾病具有較好的療效，但用于NEC的治療尚無報(bào)道[5]。鑒于川芎嗪具有治療NEC的藥理基礎(chǔ)，且在腸道疾病治療方面具有一定的臨床基礎(chǔ)，筆者采用缺氧冷應(yīng)激聯(lián)合配方奶侵襲性喂養(yǎng)法建立NEC新生大鼠模型，探討川芎嗪對(duì)NEC新生大鼠的保護(hù)作用，以期為NEC的治療及川芎嗪的臨床應(yīng)用提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

磷酸川芎嗪膠囊（批號(hào)2017011124，甘肅省西峰制藥有限責(zé)任公司），強(qiáng)化配方乳、丙二醛檢測試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒、小鼠抗人半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3（cysteine aspartic acid specific protease-3，caspase-3）抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體（美國Sigma公司）。

出生48 h內(nèi)的健康無特定病原體級(jí)新生Sprague-Dawley大鼠 50 只，體質(zhì)量為（200±20）g，雌雄不限，購于西北農(nóng)林科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK（陜）2017-0004。飼養(yǎng)條件為溫度18～28℃，相對(duì)濕度55%，自由進(jìn)食飲水，日常光照。本研究所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均獲得榆林市第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

TB-P1生物組織自動(dòng)包埋機(jī)（上海三崴醫(yī)療設(shè)備有限公司），TD5多管架自動(dòng)平衡高速離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司），ZG-680酶標(biāo)儀（無錫集佳智能科技有限公司），TH4-200光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥劑量

按成人劑量的6.25倍計(jì)算大鼠給藥劑量。其中成人體質(zhì)量以60 kg計(jì)，則磷酸川芎嗪膠囊的人體正常劑量應(yīng)為：50 mg/60 kg=0.83 mg/kg。再進(jìn)一步按照公式計(jì)算可得出每天每只新生大鼠的給藥劑量為：6.25×0.83 mg/kg=5.18 mg/kg，并以 2.09 mg/kg為低劑量，5.18 mg/kg為中劑量，10.36 mg/kg為高劑量。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、造模及給藥方法

將出生48 h內(nèi)的健康新生Sprague-Dawley大鼠50只按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、低劑量組、中劑量組及高劑量組，每組10只。除空白組外，其他各組新生大鼠均采用缺氧冷應(yīng)激聯(lián)合配方奶侵襲性喂養(yǎng)法建立NEC模型，即將新生大鼠與母鼠分離，每天 9∶00、13∶00、17∶00 及 21∶00 分別采用強(qiáng)化配方乳經(jīng)口插管喂養(yǎng)1次，每次0.15 ml，1 d后增至每次0.20 ml；并于每天9∶00給予4℃寒冷刺激10 min，21∶00給予缺氧刺激（氧氣體積分?jǐn)?shù)＜2%的氮?dú)猓?0 s；每天9∶00缺氧冷應(yīng)激與強(qiáng)化配方乳經(jīng)口插管喂養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)低、中、高劑量組新生大鼠進(jìn)行插管給藥，川芎嗪的給藥劑量分別為2.09、5.18、10.36 mg/kg，連續(xù)給藥3 d；模型組給予等體積的氯化鈉注射液；空白組則不予任何處理，均由哺乳期母鼠代乳。

1.2.3 標(biāo)本處理及觀察指標(biāo)

末次人工喂養(yǎng)12 h后，采用頸椎脫臼法處死各組大鼠，分離回盲部腸組織，并于距回盲部4 cm范圍內(nèi)剪取長度約3 cm的全層回腸末端組織，平均分為3份。

取其中1份回盲部腸組織，利用玻璃勻漿器將其制成組織勻漿液，采用硫代巴比妥酸比色法檢測勻漿液中的丙二醛和CAT水平，雙位點(diǎn)夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測勻漿液中的GSH-Px和SOD水平。另取1份回盲部腸組織，依次經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定、石蠟包埋及切片處理，采用蘇木精-伊紅染色觀察回盲部腸組織的病理學(xué)變化，并采用Khailova標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行回盲部腸組織損傷評(píng)分，其中0分為回盲部腸組織結(jié)構(gòu)正常，且絨毛及上皮均完整；1分為回盲部腸組織黏膜固有層輕微腫脹分離；2分為回盲部腸組織黏膜固有層中度腫脹分離；3分為回盲部腸組織黏膜固有層重度腫脹分離，黏膜下肌層水腫并伴局部絨毛脫落；4分為腸壞死伴回盲部腸組織絨毛消失。取剩余回盲部腸組織，根據(jù)免疫組化相關(guān)方法，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法依次進(jìn)行石蠟切片脫蠟、水化、抗原修復(fù)、一抗結(jié)合、二抗結(jié)合、二氨基聯(lián)苯氨顯色、蘇木素復(fù)染、乙醇脫水、二甲苯透明及封片處理，觀察caspase-3蛋白表達(dá)情況（陽性表達(dá)為棕褐色），并進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 川芎嗪對(duì)NEC新生大鼠回盲部腸組織勻漿中氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

由表1可知，與模型組相比，低、中、高劑量組新生大鼠回盲部腸組織勻漿中的丙二醛水平均明顯降低，而CAT、GSH-Px和SOD水平均明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與空白組相比，低、中、高劑量組新生大鼠回盲部腸組織勻漿中的丙二醛水平均明顯升高，而CAT、GSH-Px和SOD水平均明顯降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表1 各組新生大鼠回盲部腸組織勻漿中氧化應(yīng)激指標(biāo)變化（Mean±SD，n=10）

2.2 川芎嗪對(duì)NEC新生大鼠回盲部腸組織病理學(xué)變化的影響

蘇木精-伊紅染色結(jié)果顯示，空白組新生大鼠回盲部腸組織結(jié)構(gòu)均正常，腸上皮與絨毛均較為完整（圖1A）；模型組新生大鼠腸絨毛參差不齊，腺體排列紊亂，部分絨毛脫落及壞死，回盲部腸組織嚴(yán)重壞死，黏膜固有層重度腫脹分離，肌層嚴(yán)重變?。▓D1B）；低、中、高劑量組新生大鼠伴有腸絨毛輕中度充血水腫及回盲部腸組織黏膜固有層輕中度腫脹分離，但程度均不及模型組（圖1C～1E）。進(jìn)一步采用Khailova標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行回盲部腸組織損傷評(píng)分，結(jié)果顯示，空白組、模型組、低劑量組、中劑量組及高劑量組的回盲部腸組織損傷評(píng)分分別為（0.12±0.01）、（3.21±0.43）、（1.91±0.33）、（1.56±0.31）及（1.35±0.26）分。與模型組相比，空白組及低、中、高劑量組的回盲部腸組織損傷評(píng)分均明顯降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05）；與空白組相比，低、中、高劑量組的回盲部腸組織損傷評(píng)分均明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.3 川芎嗪對(duì)NEC新生大鼠回盲部腸組織中caspase-3蛋白表達(dá)的影響

免疫組化染色結(jié)果顯示，caspase-3蛋白在空白組新生大鼠回盲部腸組織中僅見微量表達(dá)，在模型組呈棕黃色強(qiáng)陽性表達(dá)，而在低、中、高劑量組陽性表達(dá)均明顯減弱（圖2）。半定量分析結(jié)果顯示，與模型組（9.34±0.98）相比，空白組及低、中、高劑量組回盲部腸組織中的caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量（1.00±0.00、5.51±0.57、4.46±0.45、2.15±0.21）均明顯降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

圖1 蘇木精-伊紅染色觀察各組新生大鼠回盲部腸組織的病理學(xué)變化

圖2 免疫組化染色觀察各組新生大鼠回盲部腸組織中caspase-3蛋白的表達(dá)

3 討論與結(jié)論

NEC是早產(chǎn)兒的常見胃腸道疾病之一，具有發(fā)病率高、病死率高及治療難度大等特點(diǎn)[6]。目前，NEC的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，但公認(rèn)的可能病因有細(xì)菌定植、先天性免疫異常、炎癥反應(yīng)、腸道組織發(fā)育不成熟、腸道缺血缺氧及不當(dāng)喂養(yǎng)等[7-8]。近年來有研究結(jié)果表明，多種因素引起的腸道細(xì)胞凋亡等腸道屏障損壞，以及由此造成的系統(tǒng)性敗血癥及腸道菌群轉(zhuǎn)移所致的繼發(fā)性氧化應(yīng)激損傷可能是造成NEC的最主要病因之一，故抑制腸道細(xì)胞凋亡、改善腸道氧化應(yīng)激紊亂對(duì)于治療NEC具有重要意義[9-10]。

川芎嗪是從傘形科藁本屬植物川芎根莖中提取分離的一種生物堿單體，具有抗炎、抑制細(xì)胞凋亡、抗氧化應(yīng)激、改善微循環(huán)、擴(kuò)張血管等多種活性[11]。川芎嗪還可激活腸道激肽系統(tǒng)，擴(kuò)張腸道毛細(xì)血管，從而改善回盲部腸組織的微循環(huán)[12]。此外，川芎嗪還能有效改善腸道局部炎癥，抑制腸道炎癥因子的合成與釋放[13]。為此，本研究采用缺氧冷應(yīng)激聯(lián)合配方奶侵襲性喂養(yǎng)法建立NEC新生大鼠模型，探討了川芎嗪對(duì)NEC新生大鼠的保護(hù)作用，這對(duì)于擴(kuò)展NEC的應(yīng)用范圍及NEC的新藥研發(fā)均具有重要意義。

Caspase是一組存在于胞質(zhì)溶膠中的結(jié)構(gòu)上相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶，在細(xì)胞凋亡過程中具有重要作用，其中caspase-3為caspase家族的重要蛋白，能有效且特異性反映細(xì)胞凋亡情況[14]。有文獻(xiàn)報(bào)道，在藥物改善NEC所致回盲部腸組織損傷的同時(shí)，caspase-3蛋白表達(dá)明顯降低，亦證實(shí)了caspase-3蛋白是調(diào)節(jié)腸道細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶[15]。丙二醛、CAT、GSH-Px和SOD均為機(jī)體的重要氧化應(yīng)激指標(biāo)，其中丙二醛是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的重要產(chǎn)物之一，其產(chǎn)生還可加劇細(xì)胞膜的損傷；CAT和GSH-Px主要用于催化機(jī)體中過氧化物酶的分解，從而減輕有機(jī)氫過氧化物對(duì)正常機(jī)體的損傷，對(duì)維持機(jī)體細(xì)胞膜功能亦具有重要意義；而SOD為人體內(nèi)重要的自由基清除劑，可通過清除氧自由基來改善脂質(zhì)過氧化[16-18]。

在本研究中，與模型組相比，低、中、高劑量組回盲部腸組織勻漿中的丙二醛水平均明顯降低，而CAT、GSH-Px和SOD水平均明顯升高，提示川芎嗪能有效改善NEC所致腸道氧化應(yīng)激紊亂，這對(duì)于改善氧化應(yīng)激所致局部損傷具有重要意義。蘇木精-伊紅染色和免疫組化染色結(jié)果顯示，低、中、高劑量組腸絨毛充血水腫及回盲部腸組織黏膜固有層腫脹分離程度均不及模型組，且回盲部腸組織損傷評(píng)分、回盲部腸組織中caspase-3蛋白陽性表達(dá)均明顯低于模型組，表明川芎嗪能減輕NEC所致回盲部腸組織損傷，抑制腸道細(xì)胞凋亡，這可能是川芎嗪對(duì)NEC具有保護(hù)作用的主要機(jī)制之一。由于文獻(xiàn)較為缺乏等原因，本研究對(duì)于川芎嗪具體作用機(jī)制的探討仍不明確，后期還需深入討論。此外，本研究僅考察了川芎嗪對(duì)于NEC新生大鼠腸道氧化應(yīng)激以及caspase-3蛋白表達(dá)的影響，對(duì)于川芎嗪是否通過其他途徑改善NEC所致腸道損傷則未進(jìn)行闡述，有待于在后續(xù)研究中予以完善。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突