王萍 后岷紅

1天津市婦女兒童保健中心口腔科300070；2天津市第四中心醫(yī)院口腔科300140

0 引言

糖尿病是由遺傳和環(huán)境因素共同作用所致的一組糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂的臨床綜合征，其主要特征為高血糖和胰島素抵抗[1-3]。糖尿病的內(nèi)分泌和代謝紊亂會影響骨骼的形成和代謝，糖、脂肪、蛋白質(zhì)和微量元素代謝紊亂會導致骨礦物質(zhì)含量下降[4-5]，引起繼發(fā)性骨量減少及骨質(zhì)疏松等糖尿病性骨病。其中牙槽骨骨質(zhì)疏松為糖尿病引發(fā)的常見口腔疾病之一，會加劇牙周疾病的進展。因此，如何有效干預和治療糖尿病引發(fā)的牙槽骨骨質(zhì)疏松成為亟需解決的問題。目前其主要治療方法為西藥治療[6]。近年來有研究結果表明，中藥在治療糖尿病引發(fā)的牙槽骨吸收方面具有良好的效果[7-8]。本研究旨在通過中藥提取物黃連素進行干預，探討其對糖尿病大鼠牙槽骨吸收的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

鏈脲佐菌素（美國Sigma公司），胰島素酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（上海恪敏生物科技有限公司），TRIzol試劑盒、反轉錄PCR兩步法試劑盒（美國Invitrogen公司），二喹啉甲酸法總蛋白定量測定試劑盒、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）測定試劑盒、骨鈣素測試盒、鈣測試盒、磷測試盒（南京建成生物工程研究所），兔抗大鼠骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2,BMP-2）、Smad1、Smad4、β-肌動蛋白單克隆抗體以及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體（英國Abcam公司）。健康無特定病原體級雌性Sprague-Dawley大鼠60只，8周齡，體質(zhì)量范圍215～245 g，購于天津?qū)嶒瀯游镏行?，許可證號SCXK（津）2015-0012。本研究所有的動物實驗均獲得天津市動物實驗倫理委員會的批準。

AU5800全自動生化分析儀（美國Beckman Coulter有限公司），F(xiàn)reeStyle Optium Neo血糖儀（英國Abbott Diabetes Care有限公司），Applied BiosystemsTM自動化PCR儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），JY-SPCT水平電泳槽（北京君意東方電泳設備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病大鼠模型的建立

通過一次性腹腔注射鏈脲佐菌素（35 mg/kg）建立糖尿病大鼠模型，注射后第2天起每天8∶00測定大鼠空腹血糖及空腹胰島素（fasting insulin,Fins）值，連續(xù)測量2周，若連續(xù)空腹血糖值≥16.7 mmol/L且表現(xiàn)為對胰島素抵抗，表明2型糖尿病大鼠模型造模成功[6]。

1.2.2 動物分組及干預

實驗大鼠于天津醫(yī)科大學實驗動物中心分籠飼養(yǎng)，溫度為22～25℃，相對濕度為50%～60%，自由進水飲食，晝夜交替自然光照。適應性飼養(yǎng)1周后，將60只健康無特定病原體級雌性Sprague-Dawley大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常組、糖尿病組和黃連素組，每組20只。黃連素組和糖尿病組大鼠建立糖尿病模型后分別給予黃連素（200 mg/kg）和等體積的氯化鈉注射液灌胃，每天1次，連續(xù)灌胃4周；正常組大鼠不予任何處理。

灌胃4周后，糖尿病組大鼠死亡4只，黃連素組死亡1只，正常組無死亡。為保持3組的一致性，分別從黃連素組和正常組存活大鼠中隨機選取16只，與糖尿病組存活的16只大鼠進行后續(xù)實驗。

1.2.3 空腹血糖和Fins水平檢測

灌胃4周后，各組大鼠尾靜脈取血，采用血糖儀測量空腹血糖；取大鼠主動脈血，采用胰島素酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒測定各組大鼠的Fins水平，并計算胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model assessment of insulin resistance,HOMA-IR）和胰島素敏感指數(shù)（insulin sensitivity index,ISI）。

1.2.4 生化指標檢測

灌胃4周后，留取各組大鼠眼眶靜脈血液標本，采用對應的測試盒測定血清鈣、磷和ALP水平；留取各組大鼠尾靜脈血液標本，采用骨鈣素測試盒測定血清骨鈣素水平，上述指標檢測均由全自動生化分析儀完成。

1.2.5 蘇木精-伊紅染色

灌胃4周后，各組隨機選取8只大鼠，頸椎脫臼法處死后將大鼠頭部軟組織與骨組織分離，取大鼠下頜骨于質(zhì)量分數(shù)為10%的中性甲醛溶液中固定48 h；再于含質(zhì)量分數(shù)為15%乙二胺四乙酸二鈉的中性甲醛溶液中脫鈣4周，每4天換脫鈣液1次；常規(guī)梯度乙醇脫水，石蠟包埋，沿第一磨牙近中矢狀面將牙槽骨切成5 μm厚的切片；對切片進行蘇木精-伊紅染色，于光學顯微鏡下觀察拍照。

1.2.6 反轉錄PCR檢測BMP-2/Smad信號通路相關基因的mRNA表達

灌胃4周后，將各組剩余的8只大鼠用頸椎脫臼法處死，按1.2.4節(jié)方法取牙槽骨組織100 mg，液氮研磨后按TRIzol試劑盒說明書提取大鼠牙槽骨組織的總RNA，分光光度計測定總RNA含量。采用反轉錄PCR兩步法試劑盒將RNA反轉錄為互補DNA（cDNA），并以cDNA為模板進行PCR擴增。相關基因引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，具體序列見表1。PCR反應條件為：94℃變性1 min，61℃退火30 s，72℃延伸1 min，共45個循環(huán)。將擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像分析系統(tǒng)測定各電泳條帶灰度值，以β-肌動蛋白基因為內(nèi)參基因，計算各目的基因的mRNA相對表達量。

表1 反轉錄PCR相關基因引物序列

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測BMP-2/Smad信號通路相關基因的蛋白表達

將1.2.6節(jié)中提取總RNA后的牙槽骨組織剩余物以1 500 r/min離心30 min（離心半徑10 cm），取上清（粗體蛋白），采用二喹啉甲酸法測定蛋白濃度。各組取蛋白樣品40 μg，進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（70V、30min，95V、90min）；電泳結束后將凝膠上的蛋白轉至聚偏二氟乙烯膜上（200 mA、3 h）；加入質(zhì)量濃度為50 g/L的脫脂牛奶，4℃封閉過夜；分別加入兔抗大鼠BMP-2、Smad1、Smad4、β-肌動蛋白單克隆抗體（稀釋比例均為1∶1 000），4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液洗去未結合的抗體；加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體（1∶1 000），37 ℃孵育 1 h，磷酸鹽緩沖液洗去未結合的抗體；經(jīng)增強化學發(fā)光法顯色、照相后，采用Quantity One v4.6.6軟件分析各蛋白條帶灰度值，以β-肌動蛋白為內(nèi)參，計算各目的蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計量資料以均值±標準差（Mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析及q檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 黃連素對糖尿病大鼠空腹血糖、Fins水平及HOMA-IR、ISI的影響

由表2可知，與正常組相比，糖尿病組大鼠的空腹血糖、Fins水平及HOMA-IR均升高，ISI降低，差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；與糖尿病組相比，黃連素組大鼠的空腹血糖、Fins水平及HOMA-IR均降低，ISI升高，差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

2.2 黃連素對糖尿病大鼠血清鈣、磷、ALP和骨鈣素水平的影響

由表3可知，與正常組相比，糖尿病組大鼠的血清鈣、磷、ALP和骨鈣素水平均降低，差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；與糖尿病組相比，黃連素組大鼠血清鈣、磷、ALP和骨鈣素水平均升高，差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

2.3 黃連素對糖尿病大鼠牙周組織病理學的影響

蘇木精-伊紅染色結果見圖1，灌胃4周后正常組大鼠牙槽骨未見骨質(zhì)吸收，糖尿病組大鼠牙槽骨骨質(zhì)吸收明顯，而黃連素組大鼠牙槽骨骨質(zhì)吸收較糖尿病組明顯減輕，表明予以黃連素干預后糖尿病組大鼠牙槽骨吸收減輕。

表2 灌胃4周后各組大鼠的空腹血糖、Fins水平及HOMA-IR、ISI（n=16，Mean±SD）

2.4 黃連素對糖尿病大鼠牙槽骨組織中BMP-2/Smad信號通路相關基因的mRNA和蛋白表達的影響

由圖2和圖3可知，與正常組相比，糖尿病組大鼠牙槽骨組織中 BMP-2、Smad1、Smad4基因的mRNA和蛋白表達明顯降低（均P＜0.05）；而與糖尿病組相比，黃連素組大鼠牙槽骨組織中BMP-2、Smad1、Smad4基因的mRNA和蛋白表達明顯升高（均P＜0.05），表明黃連素可能通過上調(diào)BMP-2/Smad信號通路減輕糖尿病大鼠的牙槽骨骨質(zhì)吸收。

表3 灌胃4周后各組大鼠的血清鈣、磷、ALP和骨鈣素水平（n=16，Mean±SD）

圖1 蘇木精-伊紅染色觀察灌胃4周后各組大鼠牙周組織的病理學變化（×40）

圖2 反轉錄PCR檢測灌胃4周后各組大鼠牙槽骨組織中BMP-2、Smad1和Smad4的mRNA表達

3 討論與結論

糖尿病性骨質(zhì)疏松癥是糖尿病的一種常見并發(fā)癥，雖然增加骨質(zhì)疏松癥風險的可能因素有許多，但糖尿病是骨質(zhì)疏松癥的最主要原因之一。研究結果表明，與非糖尿病患者和血糖控制良好的糖尿病患者相比，血糖控制欠佳的糖尿病患者骨折風險大為增加[7-9]。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病原因十分復雜，該病在發(fā)生骨折前并無其他癥狀，其主要發(fā)病機制為機體的骨重建失衡。在生理情況下，骨吸收和修復活動保持平衡，從而維持骨代謝的穩(wěn)態(tài)；而糖尿病可通過不同方式影響骨吸收和修復活動的平衡，尤其是牙槽骨骨質(zhì)疏松加劇了牙周疾病的進展，故有效治療糖尿病性骨質(zhì)疏松癥對于糖尿病患者牙周疾病的防治具有重要的臨床意義。黃連素又名小檗堿，臨床上被作為抗菌藥長期用于解熱、解毒、抗腸道感染，其用于治療糖尿病亦有多年[10-11]。文獻報道，黃連素能有效降低糖尿病患者的血糖，提高胰島素的療效[12-13]，是極具潛力的降糖中藥提取物。

目前，對于黃連素治療糖尿病的具體機制及降糖療效與安全性仍處于研究中[13-14]。本研究探討了黃連素干預對糖尿病大鼠牙槽骨骨質(zhì)疏松的影響，結果顯示，與糖尿病組相比，黃連素組大鼠的空腹血糖、Fins水平和HOMA-IR均降低，而ISI升高。該結果表明黃連素干預可有效控制血糖，提高胰島素的療效，改善胰島素抵抗。ALP為骨形成的標志物，血清骨鈣素水平為反映體內(nèi)成骨細胞功能及骨質(zhì)礦化的特殊標志物[15]。本研究對各組大鼠的血清鈣、磷、ALP及骨鈣素含量進行測定，結果顯示，連續(xù)灌胃黃連素4周后，糖尿病大鼠的血清鈣、磷、ALP和骨鈣素水平均升高，表明黃連素干預可明顯改善糖尿病所致的大鼠牙槽骨骨質(zhì)疏松，抑制牙槽骨的吸收，對牙周組織具有保護作用，但該保護作用的分子生物學機制仍需進一步探討。

聶瑩等[16]的研究結果發(fā)現(xiàn)，BMP-2信號通路在糖尿病大鼠牙槽骨缺損修復過程中具有重要作用。因此本研究進一步通過反轉錄PCR和Western Blot對BMP-2/Smad信號通路進行檢測，結果顯示，與正常組相比，糖尿病組大鼠牙槽骨組織中BMP-2、Smad1、Smad4的mRNA和蛋白表達均明顯降低；經(jīng)黃連素干預后，BMP-2、Smad1、Smad4 的 mRNA 和蛋白表達均明顯升高。高糖環(huán)境可影響多種激素和細胞因子，這些激素和細胞因子的變化均可能影響牙槽骨組織中BMP-2、Smad1、Smad4的mRNA和蛋白表達，進而影響骨代謝。本研究結果提示，黃連素可能通過上調(diào)BMP-2/Smad信號通路減輕糖尿病大鼠牙槽骨的吸收，這與聶瑩等[16]的研究結果相一致。此外蘇木精-伊紅染色結果顯示，正常組大鼠牙槽骨未見骨質(zhì)吸收，糖尿病組大鼠牙槽骨可見骨質(zhì)吸收，而黃連素組大鼠牙槽骨骨質(zhì)吸收較糖尿病組明顯減少，亦表明黃連素干預可明顯抑制糖尿病大鼠牙槽骨的吸收。

綜上所述，黃連素干預可明顯降低糖尿病大鼠的空腹血糖水平、Fins水平及HOMA-IR，并升高ISI及血清鈣、磷、ALP和骨鈣素水平，其可能通過上調(diào)BMP-2/Smad信號通路減輕糖尿病大鼠的牙槽骨吸收。

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測灌胃4周后各組大鼠牙槽骨組織中BMP-2、Smad1和Smad4的蛋白表達

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突