郭新榮 李婉露 劉 寧 馬小衛(wèi)

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，陜西 咸陽 712046)

顱腦損傷(traumatic brain injury，TBI)臨床常表現(xiàn)為意識(shí)喪失、失語、頭痛、眩暈及認(rèn)知障礙(cognitive dysfunction，CD)等[1-2]，CD是多數(shù)TBI患者伴有的最持久、最嚴(yán)重的癥狀之一，特別是學(xué)習(xí)新知識(shí)能力減退，給個(gè)人、家庭和社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)[3]。臨床實(shí)踐表明電針治療TBI后CD療效肯定[4-5]。為進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)研究電針對TBI后CD大鼠海馬磷酸化認(rèn)知缺陷突觸相關(guān)蛋白(SynGAP)的調(diào)控作用，以期為電針治療TBI后CD的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD雄性大鼠80只，體質(zhì)量220～240 g，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(陜)2012-003號(hào)。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度18～24 ℃,濕度60%～70%，自由飲水，自然光照。

1.1.2 主要試劑 4%多聚甲醛溶液、含戊二醛的4%多聚甲醛溶液(美國Sigma公司)；2.5%戊二醛溶液(湖北新景新材料有限公司)；兔抗SynGAP一抗(武漢博士德生物工程有限公司)；即用型鏈霉親和素—生物素—過氧化物酶復(fù)合物(SABC)免疫組化染色試劑盒(兔源二抗)(武漢博士德生物工程有限公司)；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；2%戊巴比妥鈉溶液[默克化工技術(shù)(上海)有限公司]；硫酸慶大霉素注射液(國藥集團(tuán)容生制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H41024153)；注射用氨芐西林鈉[石藥集團(tuán)中諾藥業(yè)(石家莊)有限公司，國藥準(zhǔn)字H13021267]。

1.1.3 主要儀器 腦立體定位儀(ST-3ND型，成都儀器廠)；電子顱腦損傷儀(eCCI-6.3型，美國VCU大學(xué))；自動(dòng)酶標(biāo)儀(Spectra M5型，美國Molecular Devices公司)；MORRIS水迷宮視頻分析系統(tǒng)(RD1101-MWM-G型，上海移數(shù)信息科技有限公司)；超聲波細(xì)胞粉碎儀(JY92-Ⅱ型，寧波新藝超聲設(shè)備有限公司)；微型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(5417R型，德國Eppendorf公司)；脫色搖床(TY-80S型，南京新校園生物技術(shù)研究所)；基礎(chǔ)型電源(美國Bio-Rad公司)；電泳槽(美國Bio-Rad公司)；轉(zhuǎn)印槽(美國Bio-Rad公司)；正置研究級顯微鏡(日本Nikon)；日立透射電子顯微鏡(H-7650型，日本日立)；電針儀(G6805-1A型，上海華誼醫(yī)用儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物選擇及分組 將80只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后開始用水迷宮實(shí)驗(yàn)篩選動(dòng)物。每日上午1次，第4次水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將>90 s始終不能找到平臺(tái)的大鼠或<3 s能迅速找到平臺(tái)的大鼠剔除，共剔除16只。余64只納入研究，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為2組，即空白組10只、造模組54只。

1.2.2 模型制備[6]除空白組10只大鼠外，造模組54只大鼠均進(jìn)行TBI模型制備。大鼠術(shù)前禁食禁水8 h，腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液麻醉，將大鼠俯臥位固定于腦立體定位儀，頭頂正中消毒，切開皮膚，剝離骨膜，暴露右頂骨，定位標(biāo)記冠狀縫后3 mm、中線右側(cè)旁開2.5 mm，用微型磨鉆鉆半徑為2 mm的骨窗，大鼠移至電子顱腦損傷儀上，設(shè)置參數(shù)為速度4 m/s、深度3 mm，打擊；打擊后如有出血，壓迫止血，傷口處滴硫酸慶大霉素注射液4～5 滴，骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮，縫合后用紅霉素軟膏涂抹縫合處及周圍。將大鼠放在棉墊上，保持呼吸暢通，注意保暖，待大鼠蘇醒后單籠飼養(yǎng)。術(shù)后予注射用氨芐西林鈉125 mg肌肉注射抗感染，每日1次，連用3 d。造模組在TBI造模過程中死亡4只，余50只又按造模前4次水迷宮實(shí)驗(yàn)的逃避潛伏期成績，從用時(shí)由多到少依次篩選出34只，隨機(jī)分為模型組、電針組，各17只。對大鼠的處置嚴(yán)格按照《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》[7]。

1.2.3 治療方法 電針組大鼠予電針治療。動(dòng)物固定于自制鼠板上，取百會(huì)、人中、左側(cè)內(nèi)關(guān)、左側(cè)后三里、左側(cè)絕骨，定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[8]，百會(huì)：頂骨正中；人中：唇裂鼻尖下1 mm正中；內(nèi)關(guān)：前肢內(nèi)側(cè)，離腕關(guān)節(jié)約3 mm的尺橈骨縫間；后三里：膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，在腓骨小頭下約5 mm；絕骨：大鼠外踝上3 mm處。針刺操作：穴位消毒，選28號(hào)0.5寸華佗牌毫針，向前斜刺百會(huì)，直刺人中，直刺左側(cè)內(nèi)關(guān)、左側(cè)后三里、左側(cè)絕骨，刺入深度為(5.0±0.2) mm，各穴行捻轉(zhuǎn)手法，得氣后留針。后三里接電針儀負(fù)極，絕骨接電針儀正極，選2 Hz、1 mA、連續(xù)波，每次20 min，每日1次，5次為1個(gè)療程，療程間休息2 d，共治療2個(gè)療程?？瞻捉M、模型組大鼠，每日抓拿1次，同樣方法固定20 min，常規(guī)消毒相應(yīng)治療穴位，療程同電針組。

1.3 觀察指標(biāo)及方法

1.3.1 水迷宮實(shí)驗(yàn) 自電針組大鼠進(jìn)行電針治療之日，各組隨機(jī)取8只大鼠進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)。

1.3.1.1 定位航行實(shí)驗(yàn) 大鼠依次從4個(gè)象限進(jìn)入水中，90 s內(nèi)爬上平臺(tái)的則記錄所用時(shí)間，即為逃避潛伏期；90 s內(nèi)未找到平臺(tái)的則逃避潛伏期記錄為90 s。各組試驗(yàn)期間，每日上午水迷宮實(shí)驗(yàn)測試1次，連續(xù)進(jìn)行12次。

1.3.1.2 空間探索實(shí)驗(yàn) 最后一次定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，撤除平臺(tái)，將大鼠放入水中觀察，記錄大鼠90 s內(nèi)經(jīng)過原平臺(tái)所在區(qū)域次數(shù)。

1.3.2 光鏡觀察海馬CA1、CA3、DG區(qū)腦組織大體形態(tài)結(jié)構(gòu) 治療結(jié)束后，各組隨機(jī)取2只大鼠，予0.9%氯化鈉注射液200 mL、4%多聚甲醛溶液200 mL心臟灌注，斷頭取腦組織，辨認(rèn)海馬CA1、CA3、DG區(qū)。蘇木素—伊紅(HE)染色，光鏡下觀察大鼠海馬CA1、CA3、DG區(qū)腦組織大體形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.3.3 電鏡觀察海馬CA1、CA3區(qū)腦組織超微結(jié)構(gòu) 各組從余下大鼠中再隨機(jī)取2只大鼠，予含戊二醛的4%多聚甲醛溶液300 mL進(jìn)行心臟灌注固定。斷頭取腦組織，在蠟板上用手術(shù)刀片橫斷面切開腦組織，辨認(rèn)海馬CA1、CA3區(qū)，切下目標(biāo)部位約2 mm×2 mm，放入2.5%戊二醛溶液中固定。送西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部電鏡室，經(jīng)清洗、脫水、浸透、包埋、切片、染色等步驟制成厚度50～70 nm的透射電鏡切片，電鏡下觀察海馬CA1、CA3區(qū)腦組織超微結(jié)構(gòu)。

1.3.4 免疫印跡(Western Blot)檢測海馬區(qū)腦組織SynGAP含量 各組從余下大鼠中再隨機(jī)取6只大鼠，心臟灌注后斷頭取腦組織，分離出海馬區(qū)，稱質(zhì)量記錄，并分成3份(每份>50 mg)，分別放入3個(gè)無菌離心管中，過液氮后放入超低溫冰箱凍存。蛋白樣品用高效RIPA法制備，BCA法測定蛋白濃度。上樣蛋白的制備；制12%的分離膠、5%的濃縮膠，灌膠；上樣；60 V低電壓電泳30 min，90 V電泳90 min；轉(zhuǎn)膜(400 mA，2.0 h)；洗膜(TBST洗5 min，2次；TBS洗10 min)；5%脫脂乳封閉，脫色；孵一抗(濃度1∶500～5 000)，4 ℃冰箱過夜；洗膜；孵二抗(濃度1∶5 000)過夜；洗膜；ECL發(fā)光(5～45 s)。圖像采集處理，設(shè)β-actin為內(nèi)參，用Image Pro Plus 6.0軟件分別計(jì)算SynGAP和β-actin條帶的灰度和面積之乘積，再分別計(jì)算出SynGAP與β-actin的比值，獲得SynGAP相對含量。

2 結(jié) 果

2.1 水迷宮實(shí)驗(yàn)

2.1.1 各組大鼠逃避潛伏期比較 見表1。

由表1可見，第1～12次水迷宮實(shí)驗(yàn)，模型組、電針組大鼠逃避潛伏期均較空白組延長(P<0.05)；與模型組比較，第1次水迷宮實(shí)驗(yàn)，電針組逃避潛伏期較模型組延長，第2～7次較模型組縮短，但比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；第8～12次水迷宮實(shí)驗(yàn)，電針組大鼠逃避潛伏期均較模型組縮短(P<0.05)。

表1 各組大鼠逃避潛伏期比較

2.1.2 各組大鼠90 s內(nèi)經(jīng)過原平臺(tái)所在區(qū)域次數(shù)比較 見表2。

表2 各組大鼠90 s內(nèi)經(jīng)過原平臺(tái)所在區(qū)域次數(shù)比較 次，

由表2可見，模型組大鼠90 s內(nèi)經(jīng)過原平臺(tái)所在區(qū)域次數(shù)少于空白組(P<0.05)；電針組大鼠90 s內(nèi)經(jīng)過原平臺(tái)所在區(qū)域次數(shù)多于模型組(P<0.05)；電針組與空白組大鼠90 s內(nèi)經(jīng)過原平臺(tái)所在區(qū)域次數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組大鼠光鏡下海馬區(qū)腦組織大體形態(tài)結(jié)構(gòu) 空白組大鼠海馬區(qū)錐體細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞間隙適當(dāng)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。模型組大鼠海馬區(qū)錐體細(xì)胞層變薄、稀疏、排列紊亂，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，甚至有大量細(xì)胞缺失。與模型組相比，電針組大鼠海馬區(qū)錐體細(xì)胞層增厚，神經(jīng)元的萎縮、核固明顯縮少。見封2，圖1。

2.3 各組大鼠電鏡下海馬區(qū)腦組織超微結(jié)構(gòu) 空白組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞核飽滿，染色質(zhì)均勻，胞核膜皺縮不明顯；突觸數(shù)量多，前膜內(nèi)囊泡多，前后膜邊界清楚，后膜致密物質(zhì)厚，活性區(qū)長度長。模型組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞核有固縮，染色質(zhì)不均勻；胞核膜明顯皺縮；線粒體有腫脹、空泡；突觸數(shù)量減少，前后膜邊界不清、甚或融合，前膜內(nèi)嚢泡減少、突觸后膜致密物質(zhì)稀疏，活性區(qū)長度較短。電針組海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞核較為飽滿，染色質(zhì)均勻，胞核膜皺縮不明顯；突觸數(shù)量較多，前膜內(nèi)囊泡較多，前后膜邊界清楚，后膜致密物質(zhì)較厚，活性區(qū)長度較長。見圖2。

2.4 各組大鼠海馬區(qū)腦組織SynGAP相對含量比較 見表3。

表3 各組大鼠海馬區(qū)腦組織SynGAP相對含量比較

由表3可見，模型組大鼠海馬區(qū)腦組織SynGAP相對含量低于空白組(P<0.05)；電針組大鼠海馬區(qū)腦組織SynGAP相對含量高于模型組(P<0.05)；電針組與空白組大鼠海馬區(qū)腦組織SynGAP相對含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組大鼠海馬區(qū)腦組織SynGAP相對含量表達(dá)條帶圖見圖3。

圖3 各組大鼠海馬區(qū)腦組織SynGAP相對含量表達(dá)條帶圖

2.5 各組大鼠海馬CA1、CA3、DG區(qū)SynGAP的IOD比較 見表4。

表4 各組大鼠海馬CA1、CA3、DG區(qū)SynGAP的IOD比較

由表4可見，模型組大鼠海馬CA1、CA3、DG區(qū)SynGAP的IOD均低于空白組(P<0.05)；電針組大鼠海馬CA3、DG區(qū)SynGAP的IOD均高于模型組(P<0.05)，CA1區(qū)則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；電針組與空白組大鼠海馬CA1、CA3、DG區(qū)SynGAP的IOD比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組大鼠海馬CA1、CA3、DG區(qū)SynGAP表達(dá)見封2，圖4。

圖2 各組大鼠電鏡下海馬CA1、CA3區(qū)腦組織超微結(jié)構(gòu)(×40 000)

3 討 論

針刺治療TBI后CD大鼠選用百會(huì)、人中、內(nèi)關(guān)、后三里、絕骨穴，能醒腦開竅，調(diào)暢氣機(jī)，疏通經(jīng)絡(luò)，有利于促進(jìn)大鼠損傷腦組織的恢復(fù)[9-10]。本實(shí)驗(yàn)所選TBI動(dòng)物模型制備方法穩(wěn)定、可靠[11-12]。本研究深入研究TBI后CD的發(fā)生，故增加了水迷宮實(shí)驗(yàn)篩選[13]，結(jié)果證實(shí)模型組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期延長，空間探索實(shí)驗(yàn)也表現(xiàn)較差。水迷宮實(shí)驗(yàn)是目前用于檢驗(yàn)大鼠認(rèn)知障礙特別是學(xué)習(xí)功能障礙的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)，本研究選擇公認(rèn)的逃避潛伏期、經(jīng)過原平臺(tái)所在區(qū)域次數(shù)作為觀察指標(biāo)[14-15]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長，各組大鼠逃避潛伏期時(shí)間均縮短，可能因?yàn)榇笫箅S著水迷宮實(shí)驗(yàn)次數(shù)增多、重復(fù)而表現(xiàn)能力越來越好[16-17]，或者水迷宮實(shí)驗(yàn)本身也是一種治療方法，有利于大鼠認(rèn)知功能恢復(fù)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，電針對TBI后CD大鼠確實(shí)起到治療作用，且隨著治療時(shí)間延長，效果更明顯。

本研究觀察發(fā)現(xiàn)，電針對TBI后CD大鼠海馬光鏡下大體形態(tài)和電鏡下超微結(jié)構(gòu)均具有一定改善作用。SynGAP在哺乳動(dòng)物腦內(nèi)突觸后致密部高表達(dá)，有多個(gè)結(jié)構(gòu)域，是多個(gè)信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白之一。SynGAP上游受到N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)、鈣調(diào)蛋白依賴蛋白激酶Ⅱ(CAMKⅡ)、細(xì)胞周期素依賴蛋白激酶5(CDK5)的調(diào)控，下游又調(diào)控小G蛋白等，同時(shí)也負(fù)調(diào)控α-氨基-3-羥基-4異惡唑-丙酸(AMPA)受體向興奮性突觸后面運(yùn)輸，參與各種病理生理機(jī)制，在改善智力低下、突觸可塑性中發(fā)揮重要作用[18-19]。相關(guān)研究表明，SynGAP在海馬區(qū)高度表達(dá)，并在神經(jīng)可塑性變化及記憶形成中具有重要作用[20-21]。SynGAP通常是夾在支撐樹突棘形成其結(jié)構(gòu)的支架上，組織了大鼠肉瘤(Ras)蛋白化學(xué)信號(hào)鏈反應(yīng)的啟動(dòng)，而后者是學(xué)習(xí)所需的信號(hào)通路。當(dāng)鈣離子(Ca2+)涌入突觸后激活了CAMKⅡ，反過來將SynGAP從細(xì)胞支架處釋放出來，進(jìn)一步刺激Ras信號(hào)通路開始傳遞信號(hào)。SynGAP還通過與突觸后致密蛋白95(PSD-95)、NMDAR受體結(jié)合，形成復(fù)合物，進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶/絲裂原活化蛋白激酶(ERK/MAPK)信號(hào)通路，ERK/MAPK信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶過程[22]。本研究中，應(yīng)用Western Blot檢測海馬區(qū)腦組織SynGAP，發(fā)現(xiàn)電針組大鼠SynGAP相對含量較模型組明顯上調(diào)。進(jìn)一步免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)電針組能夠上調(diào)CA3、DG區(qū)SynGAP的IOD，對CA1區(qū)上調(diào)不明顯。

綜上所述，電針治療TBI后CD的機(jī)制可能是促進(jìn)了神經(jīng)元突觸可塑性調(diào)節(jié)，進(jìn)而調(diào)節(jié)了海馬CA3、DG區(qū)SynGAP含量。本實(shí)驗(yàn)研究存在不足的地方：在電鏡檢測海馬區(qū)腦組織超微結(jié)構(gòu)時(shí)，只觀察了海馬CA1、CA3區(qū)，未觀察海馬DG區(qū)，下一步研究應(yīng)更全面觀察海馬各個(gè)分區(qū)的超微結(jié)構(gòu)；只研究了治療結(jié)束時(shí)SynGAP表達(dá)變化，進(jìn)一步可研究隨治療次數(shù)的SynGAP的動(dòng)態(tài)變化。