李翠，陳東亮，陳曉英，雷明，郭曉云，繆劍華

廣西壯族自治區(qū)藥用植物園/廣西藥用資源保護(hù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530023

長久以來中藥用傳統(tǒng)方式為世人健康服務(wù)，其需求量正隨著人們對(duì)健康生活需求的提升而不斷增長。全世界75%以上的人口以植物作為治療、預(yù)防疾病的藥物來源。全國中藥資源普查資料顯示，我國目前處于瀕危狀態(tài)的植物有近3000種，其中藥用植物占60%～70%，特別是珍稀瀕危野生藥用植物資源量急劇下降，如紅景天、金線蓮和冬蟲夏草等，更是面臨著滅絕的危險(xiǎn)。因此，藥用植物資源的保護(hù)同其他重要資源的保護(hù)一樣，具有非常重要的戰(zhàn)略意義。

藥用植物保存方式主要有原位保存和離位保存。離位保存主要為種子保存和離體保存。超低溫保存是20世紀(jì)60年代新興的一門技術(shù)，其為種質(zhì)資源離體保存開辟了一條新路徑。藥用植物超低溫保存是指將藥用植物的莖尖、種子或花粉等組織或器官在超低溫冰箱(-80 ℃)、液氮蒸汽相(-150～-180 ℃)或液氮(-196 ℃)中冷凍保存并成功復(fù)蘇的方式[1]，目前最主要的冷源為液氮。

1 藥用植物超低溫保存原理及優(yōu)勢(shì)

超低溫保存原理主要有細(xì)胞凍害理論和溶液玻璃化理論2種。從本質(zhì)上講，藥用植物超低溫保存主要是藥用植物細(xì)胞、組織、器官等在超低溫冷凍過程中，細(xì)胞的生長和酶的代謝活動(dòng)接近停止，處于 “假死 ” 狀態(tài)，當(dāng)其恢復(fù)到合適條件時(shí)又能進(jìn)行正常的生長發(fā)育。在這一系列過程中，藥用植物細(xì)胞僅發(fā)生了可逆的物理結(jié)構(gòu)變化，化學(xué)組成并沒有發(fā)生實(shí)質(zhì)性改變，避免了材料在保存過程中可能造成的細(xì)胞活性損傷及遺傳性狀的退化和變異，因此其在解凍后仍然能保持正常細(xì)胞的生長、代謝活性、形態(tài)發(fā)生潛能及遺傳穩(wěn)定性[2]。

相對(duì)活體保存、種子保存等其他種質(zhì)資源保存方法，藥用植物超低溫保存不受季節(jié)、土壤、氣候等自然環(huán)境條件影響，能使保存的材料免受病、蟲、毒的侵害，便于國際和地區(qū)間的種質(zhì)交換，隨時(shí)快速繁殖大量健康植株，保存過程可以減少大量人力、物力和財(cái)力，更重要的是使種質(zhì)資源得以長期保存且不需考慮基因丟失、遺傳變異等問題。超低溫保存已成為目前公認(rèn)的最為安全、經(jīng)濟(jì)、有效的藥用植物種質(zhì)資源保存方法，尤其是針對(duì)中間性種子藥用植物、頑拗性種子藥用植物及無性繁殖藥用植物材料。

2 藥用植物超低溫保存技術(shù)

2.1 材料的選擇

材料大小、抗凍性及細(xì)胞的生理狀態(tài)和年齡等因素對(duì)超低溫保存效果有較大的影響，其中植物細(xì)胞的生長年齡是決定復(fù)蘇率的最重要因素[3]，因此，應(yīng)根據(jù)植物種類，選擇適宜進(jìn)行超低溫保存的材料類型并適時(shí)取材。藥用植物超低溫保存材料主要有幼嫩組織、組織培養(yǎng)物和植物器官三大類。從目前的研究來看，大多數(shù)植物材料在成熟期的冷凍保存效果較好。種子在形態(tài)后熟和生理后熟過程中自由水含量大大降低，是目前超低溫保存應(yīng)用最多的藥用植物材料，而體積小、細(xì)胞質(zhì)稠密、無液泡、薄壁的小分生細(xì)胞的存活率高于含大量液泡的大細(xì)胞。

藥用植物的一些幼嫩組織(如莖尖分生組織和芽)因細(xì)胞分化程度低、在保存后的再生過程中遺傳穩(wěn)定性好，是超低溫保存的理想材料[2]。目前，已成功實(shí)現(xiàn)高山紅景天、百合等藥用植物莖尖的超低溫保存，液氮冷凍保存后莪術(shù)莖尖的成活率達(dá)到90%以上[4]。愈傷組織本身極易發(fā)生染色體的自發(fā)畸變而變異且胚狀體一般是由愈傷組織分化而來，因此，藥用植物愈傷組織和胚狀體是最常見的超低溫保存組織培養(yǎng)物。目前，已成功實(shí)現(xiàn)人參等植物的愈傷組織和浙貝母等植物的胚狀體的超低溫保存，且保存后成活率均在60%以上[25]。花粉和種子是藥用植物超低溫保存的2類器官材料。由于花粉和一些種子的生長壽命時(shí)間較短而遺傳多樣性又極其豐富，所以花粉和種子的保存對(duì)完善藥用植物種質(zhì)資源具有重要的意義。

2.2 材料的預(yù)處理

超低溫保存成功的關(guān)鍵在于藥用植物組織含水量的多少。低溫冰凍及化凍過程會(huì)使保存材料細(xì)胞內(nèi)水結(jié)冰、降低細(xì)胞的含水量，對(duì)材料進(jìn)行適當(dāng)脫水是植物組織保存的關(guān)鍵[3]。低溫馴化、黑暗培養(yǎng)等也是超低溫保存常用的預(yù)處理方法。

2.2.1干燥 材料含水量是決定超低溫保存能否成功的關(guān)鍵。含水量過高植物內(nèi)易形成冰晶造成機(jī)械性損傷；含水量過低會(huì)對(duì)植物組織細(xì)胞內(nèi)的束縛水進(jìn)行破壞，造成組織死亡。適當(dāng)?shù)拿撍軠p少細(xì)胞的損害，提高材料成活率[5]。常維霞等[6]對(duì)油茶花粉含水量的超低溫保存效果進(jìn)行了研究，結(jié)果表明經(jīng)脫水處理后，花粉活性隨含水量降低而降低，液氮保存后的花粉萌發(fā)率均先升高后下降，油茶花粉經(jīng)過3～5 h脫水，含水量為14.46%～15.70%時(shí)保存效果最好。曾琳等[7]研究表明，降香黃檀種子超低溫保存后發(fā)芽率和生活力隨著含水量的變化而變化，當(dāng)降香黃檀種子含水量由 15.04%降至 8.14%時(shí)，其發(fā)芽率由82.67%下降至18.35%，生活力由 85.0%降至25.0%，超低溫保存效果最好的條件是種子含水量為 15.04%。在花粉的保存中也有類似研究，當(dāng)桃葉衛(wèi)矛花粉在含水量為14.56%的初始狀態(tài)時(shí)，液氮保存后的花粉全部死亡，當(dāng)含水量降低到4.14%～12.32%時(shí)，花粉的萌發(fā)率呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，而當(dāng)花粉含水量降至1.67%時(shí)，花粉萌發(fā)率又開始下降，最終全部死亡[8]。因此，含水量與超低溫保存材料的萌發(fā)率關(guān)系緊密，是超低溫保存能否成功的關(guān)鍵因素。

2.2.2低溫馴化及暗培養(yǎng) 低溫鍛煉又稱冷馴化，通常是指將生物材料置于4～10 ℃低溫處理，可以提高藥用植物的抗凍能力。低溫可以激活藥用植物體內(nèi)的抗寒機(jī)制，通過一定時(shí)間的低溫暗培養(yǎng)馴化，可以有效提高細(xì)胞膜磷脂的不飽和程度和藥用植物體內(nèi)多胺和脯氨酸的含量，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生抗凍蛋白[9]，發(fā)生保護(hù)性脫水，提高植物的成活率。但是低溫馴化時(shí)間過長會(huì)造成的試管苗成活率下降、葉片枯黃脫落等現(xiàn)象，可能是由于在冰箱的低溫暗培養(yǎng)中，植物缺少光照、生活力減弱，導(dǎo)致植物超低溫保存后成活率下降。研究表明香石竹植株在4～8 ℃馴化后凍存，成活率達(dá)70%～80%[10]；懷山藥在低溫鍛煉7 d時(shí)成活率達(dá)最大值[11]；薄濤等[12]將繼代生長30 d的蛇莓試管苗于4 ℃冰箱中低溫鍛煉0、1、2、3、4、5、6周，經(jīng)超低溫保存后發(fā)現(xiàn)，鍛煉4周時(shí)蛇莓莖尖保存后成活率達(dá)到(28.00±5.70)%，未經(jīng)鍛煉的莖尖存活率僅為(7.00±2.74)%，但隨鍛煉時(shí)間延長，保存后莖尖存活率呈下降趨勢(shì)，鍛煉5～6周時(shí)，試管苗逐漸變黃脫葉，成活率顯著下降。因此，要合理控制低溫馴化時(shí)間。

2.3 保護(hù)劑的使用

藥用植物材料的脫水時(shí)間具有種間特異性，根據(jù)不同藥用植物的保存部位，通過改變裝載時(shí)間、冰凍保護(hù)劑、脫水時(shí)間、化凍方法等可得到適宜的冷凍保存方法。冷凍保護(hù)劑的使用是為了避免在冷凍過程中形成細(xì)胞內(nèi)冰晶，同時(shí)可以弱化水結(jié)晶,確保溶液呈高冷狀態(tài)，但其對(duì)植物均有一定的毒害作用，作用時(shí)間過長會(huì)造成細(xì)胞過度脫水，成活率下降[13]。目前應(yīng)用最廣泛的冷凍保護(hù)劑是PVS2。

李俊慧等[14]將不同玻璃化液處理的香蕉莖尖超低溫保存后的再生率進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)PVS2效果最好，其次是PVS4，但PVS4處理的結(jié)果穩(wěn)定性不好。枇杷莖尖的超低溫保存結(jié)果表明，莖尖在PVS2處理50 min時(shí)成活率最高，可達(dá)50.3%，少于50 min時(shí)由于莖尖脫水不完全而成活率不高，超過50 min則受到PVS2毒害也不易成活[15]。在馬鈴薯莖尖的研究結(jié)果類似，王家福等[16]發(fā)現(xiàn)在60%PVS2處理30 min后的莖尖成活率最高，達(dá)到71.6%，處理40 min后成活率為70.4%，50 min的成活率為68.3%。而對(duì)櫻桃砧木馬哈利離體莖尖的超低溫保存研究結(jié)果表明PVS3效果較好[17]。不同植物所用冰凍劑的作用時(shí)間以及濃度等都需要深入研究。

2.4 凍存方法

藥用植物超低溫保存凍存方法有兩步降溫法、逐步冷凍法、干燥凍存法、脫水凍存法、玻璃化法、包埋玻璃化法等。各種冷凍方法有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，在保存實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)根據(jù)不同材料來確定冷凍方法。如對(duì)菊花莖尖來說，最適宜的方法可能是小液滴快速冷凍法，而甘薯最適宜的超低溫保存方法是玻璃化法。

2.5 化凍方法

據(jù)目前的研究來看，大多數(shù)藥用植物超低溫保存材料選擇快速化凍效果較好，化凍過程中隨著溫度的升高細(xì)胞內(nèi)易形成二次結(jié)冰。冰晶最易在-50～-10 ℃時(shí)形成，此時(shí)如果解凍速度太慢，細(xì)胞內(nèi)更多的自由水會(huì)發(fā)生重結(jié)晶，從而加大對(duì)細(xì)胞的損傷。選擇適當(dāng)?shù)慕鈨龇椒商岣叱蜏乇４嫠幱弥参锏拿劝l(fā)率和復(fù)蘇率。尚曉倩等[18]對(duì)超低溫保存后的牡丹花粉采用4種化凍方法，即分別采用自來水沖洗10 min、室溫(24 ℃)化凍、30 ℃溫水浴及40 ℃溫水浴解凍，結(jié)果表明30 ℃溫水浴化凍的花粉萌發(fā)率顯著高于其他幾種方式。庫車小白杏莖尖愈傷材料在室溫下解凍的成活率最低，僅為6%，而采用40 ℃水浴5 min解凍和4 ℃冰箱解凍的成活率較高，分別為90%和84%[19]。大葉黑桫欏在室溫下化凍的孢子萌發(fā)率為47.6%～65.3%，明顯高于37 ℃水浴化凍條件下的孢子萌發(fā)率[20]，而懷山藥莖尖在40 ℃化凍溫度時(shí)復(fù)蘇率最高[11]。對(duì)于超低溫保存的扁桃晚豐18號(hào)的花粉來說，最佳的化凍方式是35 ℃解凍70 s，花粉萌發(fā)率高達(dá)63.09%[21]。

3 藥用植物超低溫保存現(xiàn)狀

超低溫保存作為植物離體保存最重要的技術(shù)之一，國內(nèi)外已對(duì)數(shù)百種植物材料進(jìn)行了超低溫保存[22]。涉及保存的材料也很眾多，有原生質(zhì)體、懸浮細(xì)胞、愈傷組織、體細(xì)胞胚、花粉、莖尖分生組織等，甚至植株幼苗[2]。目前，中國、美國、法國、德國等也已建立植物種質(zhì)資源的超低溫保存庫，對(duì)農(nóng)作物和園林植物的材料進(jìn)行超低溫保存，并取得了較為理想的效果。但是，超低溫應(yīng)用范圍還非常有限，尤其在藥用植物的保存方面報(bào)道較少，更沒有專門的藥用植物超低溫種質(zhì)資源庫。已知超低溫保存成功的藥用植物材料有百子蓮胚性愈傷組織、大苞鞘石斛原球莖、人參叢生芽、金銀忍冬花粉及莖尖、降香黃檀種子等[23-36]，但還有很多珍稀瀕危藥用植物尚無進(jìn)行超低溫保存的報(bào)道。近年來，學(xué)者們對(duì)超低溫保存前后藥用植物材料做了一些對(duì)比研究和分析，目前的研究主要集中在材料形態(tài)[23-37]、細(xì)胞[20，36]等方面，對(duì)不同基因型藥用植物、不同保存類型材料及超低溫保存機(jī)理研究較少，偶見對(duì)保存材料進(jìn)行分子和遺傳穩(wěn)定性[1，38]考察的文獻(xiàn)，缺乏真正系統(tǒng)的深入研究。藥用植物超低溫保存常用方法和路線見圖1。

圖1 藥用植物超低溫保存常用方法和路線

4 問題與展望

超低溫保存已成為目前種質(zhì)資源保存的研究熱門技術(shù)[39-41]。大規(guī)模使用超低溫技術(shù)還存在以下問題：1)超低溫保存技術(shù)應(yīng)結(jié)合植物的種間差異性研究；2)冰凍保護(hù)劑的使用及優(yōu)化；3)化凍處理方法的研究；4)影響因素較多；5)超低溫理論化的進(jìn)一步發(fā)展。但隨著低溫生物學(xué)的發(fā)展以及各學(xué)科相互借鑒和滲透，超低溫保存技術(shù)的研究將會(huì)不斷完善和深入。超低溫保存藥用植物種質(zhì)資源最主要的目的是保證其遺傳穩(wěn)定性，控制遺傳性狀的基因不發(fā)生突變，因此保存前后材料的遺傳穩(wěn)定性對(duì)比研究非常重要。對(duì)藥用植物而言，超低溫保存后復(fù)蘇材料的有效成分和藥理活性的對(duì)比研究也將是未來超低溫保存的重要考察點(diǎn)。另外，雖然理論上超低溫技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)種質(zhì)資源的“永久保存”，但由于超低溫保存技術(shù)發(fā)展時(shí)間較短，其保存的極限時(shí)間仍需更長的時(shí)間來驗(yàn)證。

藥用植物種質(zhì)資源多是重要的特有野生資源，其保存工作尤為重要。超低溫保存技術(shù)是現(xiàn)今最經(jīng)濟(jì)、安全、有效的保存手段，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍是保護(hù)珍稀瀕危藥用植物種質(zhì)資源的必然趨勢(shì)，成立國家和地方藥用植物種質(zhì)資源超低溫保存庫勢(shì)在必行。未來應(yīng)深入探究超低溫保存的原理，將超低溫保存技術(shù)與生產(chǎn)實(shí)踐有效的結(jié)合，參與藥用植物脫毒栽培、品種選育及種質(zhì)創(chuàng)新工作以解決珍稀瀕危藥用植物種質(zhì)保存工作中的難題。