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        蟾酥適宜初加工方法研究△

        2020-08-21 06:32:58羅毅范圣此和飛李秀鳳孟兆青
        中國現代中藥 2020年6期
        關鍵詞:遠華配基蟾酥

        羅毅,范圣此,和飛,李秀鳳,孟兆青

        山東宏濟堂制藥集團股份有限公司,山東 濟南 250103

        蟾酥為蟾蜍科動物中華大蟾蜍BufobufogargarizansCantor或黑眶蟾蜍B.melanostictusSchneider的耳后腺和皮膚腺的干燥分泌物,是我國傳統(tǒng)名貴中藥材。多于夏、秋兩季捕捉蟾蜍,洗凈,擠取耳后腺和皮膚腺的白色漿液,加工,干燥[1]。

        目前,蟾酥商品質量參差不齊,初加工的不規(guī)范是導致蟾酥藥材質量千差萬別的主要原因之一。蟾酥初加工方法研究已有一些報道,如:冷凍干燥、陰干、曬干、鼓風干燥等[2-5]。通過實地調研發(fā)現,蟾酥的道地主產區(qū)(臨沂)的初加工方法是在17 ℃空調室內利用風扇避光干燥?!吨腥A人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)未規(guī)定應用何種干燥方法和干燥時間,但不同的干燥方法,導致蟾酥的樣品外觀色澤(深黃色、黃色、淺黃色、白色)和化學成分的含量及組成比例存在較大差異,嚴重影響了蟾酥藥材質量和臨床療效?;诖耍狙芯坎捎?種不同的干燥方法(17 ℃風干、60 ℃烘干、80 ℃烘干、105 ℃烘干、120 ℃烘干、陰干、曬干、冷凍干燥)處理鮮蟾酥樣品,通過觀察干蟾酥的外觀色澤并利用HPLC對干蟾酥的沙蟾毒精、遠華蟾毒精、蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基6種成分進行測定,確定蟾酥適宜的初加工方法,為蟾酥的初加工規(guī)范化提供理論依據。

        1 材料

        Agilent 1260高效液相系統(tǒng);萬分之一電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司);pH計(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

        沙蟾毒精對照品(批號:20180945,純度>99.0%)、遠華蟾毒精對照品(批號:20181089,純度>98.0%)、蟾毒它靈對照品(批號:20180314,純度>99.0%)、蟾毒靈對照品(批號:111981-201501,純度>98.0%)均購于天津萬象恒遠科技有限公司;華蟾酥毒基對照品(批號:110803-201406,純度>99.6%)、酯蟾毒配基對照品(批號:110718-201108,純度>98.0%)均購于中國食品藥品檢定研究院;乙腈為色譜純;水為超純水;其余試劑為分析純。

        鮮蟾酥樣品采于臨沂費縣,由山東中醫(yī)藥大學林桂濤教授鑒定為蟾蜍科動物中華大蟾蜍B.bufogargarizansCantor耳后腺和皮膚腺分泌的白色漿液。

        2 方法和結果

        2.1 樣品制備

        蟾酥鮮漿用60目篩過濾,去除雜質,然后用藥勺將鮮漿轉移至模具中,按照不同的干燥方法(17 ℃風干、60 ℃烘干、80 ℃烘干、105 ℃烘干、120 ℃烘干、陰干、曬干、冷凍干燥)進行干燥,每隔一段時間進行稱量,至連續(xù)2次稱量質量不再變化為止,制成直徑20 mm,高約7 mm規(guī)格的圓餅狀蟾酥。

        2.2 蟾酥外觀色澤

        蟾酥鮮漿經過不同的干燥方法(17 ℃風干、60 ℃烘干、80 ℃烘干、105 ℃烘干、120 ℃烘干、陰干、曬干、冷凍干燥)制成的餅狀蟾酥及其粉碎成細粉外觀色澤出現明顯的差異(見圖1)。鮮漿未經過加工呈現灰白色,膏體狀態(tài)。經過冷凍干燥后的蟾酥為灰白色的粉末狀態(tài),而其他加工后的蟾酥為褐色的塊狀。蟾酥粉粹后,17 ℃風干、60 ℃烘干、陰干、曬干及冷凍干燥顏色較淺;80 ℃烘干、105 ℃烘干、120 ℃烘干的蟾酥顏色較深,隨著溫度越高,顏色越深。粉粹后蟾酥的顏色由淺變深變化為:冷凍干燥、曬干、17 ℃風干、陰干、60 ℃烘干、80 ℃烘干、105 ℃烘干、120 ℃烘干。

        注:A. 鮮漿;B. 60 ℃烘干的餅狀蟾酥;C. 80 ℃烘干的餅狀蟾酥;D. 105 ℃烘干的餅狀蟾酥;E. 120 ℃烘干的餅狀蟾酥;F. 陰干的餅狀蟾酥;G. 曬干的餅狀蟾酥;H. 冷凍干燥的餅狀蟾酥;I. 17 ℃風干的餅狀蟾酥;J. 60 ℃烘干的粉碎后細粉;K. 80 ℃烘干的粉碎后細粉;L. 105 ℃烘干的粉碎后細粉;M. 120 ℃烘干的粉碎后細粉;N. 陰干的粉碎后細粉;O. 曬干的粉碎后細粉;P. 冷凍干燥的粉碎后細粉;Q. 17 ℃風干的粉碎后細粉。圖1 不同干燥方法餅狀蟾酥及粉碎后的細粉

        2.3 不同干燥方法的蟾酥樣品6種蟾酥內酯類成分含量測定

        2.3.1方法學考察

        2.3.1.1對照品溶液的制備 精密稱取沙蟾毒精、遠華蟾毒精、蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、酯蟾毒配基對照品10 mg,置于5 mL量瓶中,加入甲醇制得對照品質量濃度為2 mg·mL-1。精密吸取適量上述6種對照品溶液,加入適量甲醇配置成沙蟾毒精0.045 mg·mL-1、遠華蟾毒精0.009 mg·mL-1、蟾毒它靈0.03 mg·mL-1、蟾毒靈0.025 mg·mL-1、華蟾酥毒基0.051 mg·mL-1、酯蟾毒配基0.031 mg·mL-1的混合對照品溶液,備用。

        2.3.1.2供試品溶液的制備 精密稱定蟾酥細粉25 mg,置于具塞錐形瓶中,加入甲醇溶液20 mL,稱定質量,加熱回流提取1 h,放置冷卻至室溫,再稱定質量,用甲醇補充減失的質量,搖勻,0.22 μm濾過,取續(xù)濾液,即得。

        2.3.1.3色譜條件 采用Alltima C18(250 mm×4.6 mm,5 μm) 色譜柱,流動相為乙腈(A)-0.1%甲酸(B),梯度洗脫(0~20 min,20%A;20~40 min,30%~35%A;40~60 min,35%~60%A;60~75 min,60%A);流速0.7 mL·min-1;柱溫:25 ℃;檢測波長:296 nm;進樣量:10 μL。色譜圖見圖2。

        2.3.1.4線性關系考察 以對照品質量濃度(X)為橫坐標,峰面積(Y)為縱坐標進行線性回歸處理,得沙蟾毒精、遠華蟾毒精、蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基和酯蟾毒配基回歸方程,分別為:Y=13 748X+236.06(r=0.999 9),Y=9 980.3X+34.599(r=0.999 8),Y=8 447.2X+96.422(r=0.999 9),Y=11 592X+114.78(r=0.999 5),Y=15 154X+286.40(r=0.999 9),Y=8 685.8X+103.36(r=0.999 9)。6種化合物分別在0.010~0.557、0.002~0.090、0.005~0.501、0.005~0.478、0.008~0.914、0.005~0.639 mg·mL-1線性關系良好。

        2.3.1.5精密度試驗 精密吸取同一混合對照品溶液10 μL,連續(xù)進樣6次,計算6個峰面積的RSD,沙蟾毒精為0.71%、遠華蟾毒精為0.68%、蟾毒它靈為0.64%、蟾毒靈為0.72%、華蟾酥毒基為0.72%、酯蟾毒配基為0.81%,表明精密度良好。

        2.3.1.6重復性試驗 稱取蟾酥粉末約25 mg共6份,精密稱定,按供試品溶液處理方法制備樣品,測定6個化合物的質量分數的RSD,沙蟾毒精為2.46%、遠華蟾毒精為2.15%、蟾毒它靈為2.41%、蟾毒靈為3.22%、華蟾酥毒基為3.10%、酯蟾毒配基為3.09%,表明重復性良好。

        注:A.對照品;B.供試品。圖2 對照品和蟾酥供試品HPLC圖

        2.3.1.7穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液分別于2、4、6、8、12、24 h進行分析,計算6個峰面積的RSD,沙蟾毒精為0.46%、遠華蟾毒精為4.24%、蟾毒它靈為0.41%、蟾毒靈為1.47%、華蟾酥毒基為0.17%、酯蟾毒配基為0.72%,表明穩(wěn)定性良好。

        2.3.1.8回收率試驗 精密稱取適量蟾酥粉末6份,分別加入一定量的對照品,按供試品溶液處理方法制備樣品,測定,計算加樣回收率。測得6個對照品加樣回收率分別為98.24%、99.44%、98.41%、98.37%、99.15%、106.79%,RSD分別為3.37%、3.25%、3.48%、3.26%、3.50%、3.14%。

        2.3.2水分測定 按照 《中國藥典》第三法測定水分含量,結果見表1。17 ℃風干、60 ℃烘干、陰干、曬干水分為5.99%~6.26%,80 ℃烘干、105 ℃烘干、120 ℃烘干、冷凍干燥水分為5.50%~5.64%。

        2.3.3樣品測定 取17 ℃風干、60 ℃烘干、80 ℃烘干、105 ℃烘干、120 ℃烘干、陰干、曬干、冷凍干燥加工樣品制備供試品溶液,計算沙蟾毒精、遠華蟾毒精、蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、酯蟾毒配基的質量分數,每個樣品平行3次,質量分數取平均值,結果見表1。6種成分的質量分數是扣除水分得到的實測值。經過比較,8種不同的干燥方法中遠華蟾毒精、蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、酯蟾毒配基、蟾酥內酯類的質量分數沒有顯著變化,沙蟾毒精在17 ℃風干、60 ℃烘干、陰干、曬干、冷凍干燥加工方法中質量分數沒有顯著變化。但是,沙蟾毒精在60 ℃烘干、80 ℃烘干、105 ℃烘干、120 ℃烘干時,質量分數呈現下降的趨勢。

        表1 不同蟾酥初加工方法制備品中6種成分質量分數 %

        2.4 加工效率指標測定

        實驗過程中記錄每種加工方式從蟾酥鮮漿到恒定質量時的加工時間,以及干燥前后樣品的質量,計算干燥后質量與干燥前質量比值,得到樣品的折干率。不同加工方法蟾酥干燥加工時間和折干率測定結果見表2。蟾酥鮮漿在17、60、80、105、120 ℃干燥時,隨著溫度升高,加工時間逐漸縮短。冷凍干燥為2 d,17 ℃風干、陰干、曬干時間較長,分別為15、15、6 d。不同加工方法,蟾酥折干率不同,80 ℃烘干、105 ℃烘干、120 ℃烘干、冷凍干燥折干率在29.64%~31.51%,陰干、曬干、17 ℃風干、60 ℃折干率在32.34%~34.36%。

        表2 不同蟾酥初加工方法的加工時間和折干率

        3 討論

        蟾酥為國務院頒布的28種毒性中藥材之一,也是國家重點保護的二級野生動植物藥材品種之一。蟾酥療效確切、應用廣泛,目前市場供不應求,價格不斷攀升。但蟾酥的產地加工都是家庭作坊式的,導致蟾酥摻假使雜、漿液種質混雜、灰分超標,很難保證中成藥需要的蟾酥原料安全、穩(wěn)定、有效、可控。

        通過不同的干燥方法,除冷凍干燥外,17 ℃風干、60 ℃烘干、80 ℃烘干、105 ℃烘干、120 ℃烘干、陰干、曬干的蟾酥外觀性狀均符合《中國藥典》要求。而冷凍干燥的蟾酥6種化學成分質量分數沒有顯著的變化,說明冷凍干燥影響蟾酥的外觀顏色和狀態(tài)可能與蛋白質的變性有關。沙蟾毒精為蟾酥中的活性特征成分,具有強心[6]、抗腫瘤作用[7]。其在60 ℃烘干、80 ℃烘干、105 ℃烘干、120 ℃烘干時,質量分數呈現明顯下降的趨勢,表明沙蟾毒精遇到高溫高熱易受到破壞。蟾酥粉粹,過篩成細粉,17 ℃風干、60 ℃烘干、陰干、曬干、冷凍干燥蟾酥顏色較淺,80 ℃烘干、105 ℃烘干、120 ℃烘干的蟾酥顏色逐漸加深,因此把蟾酥細粉的顏色作為衡量蟾酥質量好壞的依據值得探討。

        蟾酥不同加工方法折干率為29.64%~34.36%,說明蟾酥鮮漿含水量約70%,這對于蟾酥的加工較為不利。17 ℃風干、陰干、曬干時間較長,會導致微生物的繁殖,造成蟾酥菌檢不合格,影響蟾酥的臨床應用。本研究中沙蟾毒精的含量較低,對蟾酥中蟾酥內酯類含量貢獻較低。然而,有些蟾酥樣品中沙蟾毒精質量分數遠高于其他蟾毒配基類成分[8],因此有必要把沙蟾毒精作為蟾酥初加工方法質量控制指標。綜合來看,60 ℃熱風干燥是蟾酥適宜的加工條件,該加工方法制備的蟾酥質量較佳,蟾酥加工效率較高。本研究結果與曲婷等[2]報道和《山東省中藥飲片炮制規(guī)范》2012年版中規(guī)定60 ℃烘干基本一致[9]。

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