王 磊 趙 強(qiáng) 陳曉琦 張傳雷 王新亭 陳欣菊△

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 （河南 鄭州，450046） 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居全國惡性腫瘤第4位，死亡率則高居全國惡性腫瘤第2位［1］。遺傳因素、慢性病毒感染、非酒精性脂肪性肝病、吸煙以及飲酒等均可導(dǎo)致肝癌的發(fā)生和進(jìn)展，但誘發(fā)肝癌的確切分子機(jī)制仍然未知［2］。目前，肝癌的局部治療包括肝切除術(shù)、肝移植術(shù)、局部消融治療、肝動脈介入治療和放射性核素免疫治療等，然而肝癌是一種高度耐藥且難以治療的癌癥，現(xiàn)有的治療手段不能滿足醫(yī)療需求，迫切需要發(fā)現(xiàn)新的分子生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，以制定更加精確的醫(yī)療策略［3］。成纖維細(xì)胞生長因子受體4（FGFR4）屬于受體酪氨酸激酶（RTKs）家族，過表達(dá)的FGFR4通過激活多個下游信號通路，調(diào)控細(xì)胞的生存、增殖、侵襲和遷移等，誘發(fā)肝癌［4］。靶向FGFR4信號通路成為一種治療肝癌的新策略。近年來，中醫(yī)藥在肝癌的手術(shù)和放療后的輔助治療中凸顯了獨(dú)特的優(yōu)勢［5］。扶正消瘤顆粒是河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝病診療中心協(xié)定處方，前期研究發(fā)現(xiàn)，扶正消瘤顆粒含藥血清可誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡［6］，但其體內(nèi)的抗癌藥效研究及相關(guān)機(jī)制尚不明確。因此，本研究通過建立HepG2裸鼠肝癌移植瘤模型，探討扶正消瘤顆粒在體內(nèi)抑瘤活性，以及對FGFR4、MMP2、Cyclin D1和Bcl-xL表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 4周齡SPF級雌性BALB／c裸鼠10只，體質(zhì)量16～18g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物公司，飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥研究院動物房，標(biāo)準(zhǔn)飼料飼喂，每日光照和黑暗交替各12小時。

1.2 細(xì)胞株 人肝癌HepG2細(xì)胞株由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。

1.3 藥品及試劑 扶正消瘤顆粒（FZXLG，含黃芪、黨參、菝葜、鱉甲、牡蠣等藥味）購自江陰天江藥業(yè)有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT，Cat.No.C009-1）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST，Cat.No.C010-1）、白蛋白（Alb，Cat.No.A028-2-1）以及甲胎蛋白（AFP，Cat.No.E014-1-1）測定試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所；兔抗鼠多克隆抗體FGFR4（Lot.No.E-AB-19391）、MMP2（Lot.No.GB11130）、Cyclin D1（Lot.No.BM1583）以及Bcl-xL（Lot.No.GTX100064）均購自Genetex公司；PBS緩沖液（Lot.No.G0002）、BSA（Lot.No.G5001）、蘇木素染液（Lot.No.G1004）、中性樹膠（Lot.No.G1403）、二 抗HRP標(biāo) 記 山 羊 抗 兔IgG（Lot.No.GB23303）、DAB顯色劑（Lot.No.G1211）均購自武漢塞維爾生物科技有限公司；高糖DMEM培養(yǎng)基（Lot.No.0033617）、胰酶（Lot.No.0010218）購自Biological Industries公司；胎牛血清（Lot.No.42Q7380K）、RIPA裂解液（Lot.No.N653）分別購自Gibco公司和VWR公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清和100 U／mL雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每2天更換1次培養(yǎng)基。

1.4.2 動物造模及分組干預(yù) HepG2細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶90%時進(jìn)行傳代，傳代3次后，用PBS重懸至1×107／mL，取0.2 mL細(xì)胞懸液接種于裸鼠右腋皮下，接種48 h后可觸及腫瘤結(jié)節(jié)。接種后2d，依據(jù)簡單隨機(jī)抽樣法，將動物隨機(jī)分為模型組和治療組，每組5只。按照人與小鼠體表面積換算，治療組裸鼠所需扶正消瘤顆粒量為29 g／kg，用生理鹽水配置成所需濃度，0.2 mL／只灌胃，模型組裸鼠給予0.2 mL／只生理鹽水灌胃，均2次／d，連續(xù)21 d。

1.4.3 組織樣品的處理 接種后22 d，所有動物稱取重量后，按劑量2.5 m l／kg腹腔注射水合氯醛麻醉，而后開腹，下腔靜脈采血，置于2 ml EP管中，2 000 r／min離心15 min，留取血清用作生化檢測；剝離腫瘤組織，分析天平稱重后切取0.5 cm×0.5 cm×1.0 cm大小的一塊組織置于預(yù)先留有編號標(biāo)簽的包埋框中，將裝有腫瘤組織的包埋框置于10%福爾馬林溶液中固定。其余腫瘤組織裝入2 ml EP管中置于-70℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)腫瘤重量計(jì)算抑瘤率，抑瘤率＝［1-（治療組平均瘤重／模型組平均瘤重）］×100%。

1.4.4 生化指標(biāo)檢測 動物血清中ALT、AST、Alb以及AFP等的檢測方法均參照試劑盒說明書。

1.4.5 免疫組化檢測 石蠟切片脫蠟至水，將組織切片置于盛滿檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液（pH6.0）的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，中火8 min至沸，?；?min保溫再轉(zhuǎn)中低火7 min，自然冷卻后將玻片置于PBS（pH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min；切片放入3%雙氧水溶液，室溫避光孵育25 min，將玻片置于PBS（pH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；在組化圈內(nèi)滴加3%BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30 min；輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按1∶500配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4℃孵育過夜；玻片置于PBS（pH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min；切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加二抗HRP覆蓋組織，室溫孵育50 min；玻片置于PBS（pH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min，切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加新鮮配制的DAB顯色液；蘇木素復(fù)染3 min左右，自來水洗，蘇木素分化液分化數(shù)秒，自來水沖洗，返藍(lán)；脫水封片，顯微鏡鏡檢，Pannoramic viewer軟件圖像采集。

1.4.6 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測 將兩組裸鼠腫瘤組織切成小塊，加入RIPA裂解液，4℃下12 000 r／min離心30 min取上清液，BCA法測定蛋白濃度。兩組樣品蛋白上樣量為20μg，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜；用含5%脫脂牛奶的封閉液室溫下封閉1 h，加一抗4℃孵育過夜；TBST洗3次，每次10 min；加二抗，室溫下孵育2 h，TBST洗膜后顯影，Quantity One軟件分析條帶灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 荷瘤裸鼠體重、瘤重、瘤體比以及抑瘤率情況 見表1、插頁圖1。所有裸鼠均造模成功。隨著移植瘤體積不斷增大，模型組裸鼠逐漸出現(xiàn)活動減少，進(jìn)食水減少，消瘦，呈惡病質(zhì)狀態(tài)；治療組裸鼠精神狀態(tài)明顯好于模型組，活動基本正常。

表1 荷瘤裸鼠體重、瘤重、瘤體比及抑瘤率比較 （±s）

表1 荷瘤裸鼠體重、瘤重、瘤體比及抑瘤率比較 （±s）

與模型組比較，*P＜0.05

組別 例數(shù) 體重（g） 瘤重（g） 瘤體比（%）抑瘤率（%）5 19.28±0.57 0.94±0.06 4.89±0.46 0治療組 5 20.16±0.24* 0.65±0.10* 3.23±0.53*模型組30.85

2.2 荷瘤裸鼠肝功能檢測結(jié)果 見表2。

表2 荷瘤裸鼠血清生化檢測結(jié)果比較 （±s）

表2 荷瘤裸鼠血清生化檢測結(jié)果比較 （±s）

與模型組比較，*P＜0.05

組別 例數(shù) ALT（U／L） AST（U／L） Alb（g／L） AFP（U／L）模型組5 20.76±3.71 20.39±4.93 10.19±0.57 31.91±5.12治療組5 20.59±2.98 20.68±3.76 9.98±0.63 23.45±4.78*

2.3 荷瘤裸鼠FGFR4、MMP2、Cyclin D1及Bcl-xL表達(dá)情況 免疫組化結(jié)果顯示，治療組裸鼠FGFR4、MMP2、Cyclin D1以及Bcl-xL的表達(dá)均低于模型組（P＜0.05）。見插頁圖2。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，與模型組比較，治療組裸鼠FGFR4、MMP2、Cyclin D1以及Bcl-xL的表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。見圖3。

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，正氣虧虛，瘀毒痰濕互結(jié)是肝癌發(fā)生的基本病機(jī)，正氣虛、毒邪盛是其復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。扶正消瘤顆粒由黃芪、黨參、菝葜、鱉甲、牡蠣等組成，具有益氣解毒、活血化瘀、化痰祛濕的功效，且以扶正為主，兼以祛邪，攻補(bǔ)兼施，祛邪而不傷正，主要用于各期肝癌，臨床療效可靠［6］。

本研究顯示，扶正消瘤顆粒具有明顯的抗腫瘤活性（P＜0.05），可以抑制肝癌移植瘤的生長和增殖。FGFR4是一種酪氨酸激酶受體，可選擇性地結(jié)合成纖維細(xì)胞生長因子19（FGF19），通過下游MAPK和AKT信號通路介導(dǎo)細(xì)胞效應(yīng)，誘發(fā)肝癌［7］?；|(zhì)金屬蛋白酶家族（MMPs）屬于鋅依賴性內(nèi)肽酶，在細(xì)胞侵襲和遷移過程中參與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的降解［8］，MMP-2是其一個重要成員，能降解多種細(xì)胞外基質(zhì)，如明膠、層黏連蛋白以及I型膠原等，在腫瘤細(xì)胞透過細(xì)胞外基底膜遷移以及其他過程中發(fā)揮重要作用，在肝癌組織中異常高表達(dá)，與肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［9］。細(xì)胞周期蛋白調(diào)控細(xì)胞周期的各個時相，其中參與細(xì)胞周期調(diào)控的主要因子是Cyclin。調(diào)控G1期的關(guān)鍵蛋白之一是Cyclin D1，在細(xì)胞周期中，G1期的啟動是細(xì)胞周期的關(guān)鍵，過度表達(dá)Cyclin D1蛋白可使細(xì)胞G1期縮短，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞過度增殖。研究表明，Cyclin D1基因表達(dá)下調(diào)能抑制肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡［10］。Bcl-xL是抗凋亡蛋白，其過表達(dá)可以抑制肝癌細(xì)胞凋亡［11］。本研究顯示，扶正消瘤顆?？梢韵抡{(diào)瘤體組織中FGFR4、MMP2、Cyclin D1以及Bcl-xL的表達(dá)，具有抑制肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的潛力，進(jìn)而抑制肝癌進(jìn)展。

綜上所述，扶正消瘤顆粒具有抑制HepG2肝癌裸鼠移植瘤生長的作用，其抗腫瘤機(jī)制可能與下調(diào)FGFR4、MMP2、Cyclin D1以及Bcl-xL的表達(dá)有關(guān)，為探索治療肝癌的新方法提供了思路與依據(jù)。但中藥抗腫瘤作用具有多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，扶正消瘤顆粒在體內(nèi)的抗腫瘤作用可能還有其他作用機(jī)制，尚需進(jìn)一步研究。