唐世磊 李宏武

中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院第三普通外科 （遼寧 沈陽，201508）

肝細(xì)胞肝癌（LIHC）占原發(fā)性肝癌的85%以上，是我國第4位常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率高，預(yù)后差。LIHC惡性程度較高，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已為進(jìn)展期［1］，手術(shù)根治成功率及生存率普遍較低。因此，探索影響LIHC患者預(yù)后的潛在治療靶點(diǎn)或分子機(jī)制對(duì)改善患者預(yù)后有重要價(jià)值。長鏈非編碼RNA（Lnc RNA）是長度超過200個(gè)核苷酸的內(nèi)源性小RNA，其不具備蛋白質(zhì)編碼功能，但越來越多的研究顯示，IncRNAs與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［2］。近來研究發(fā)現(xiàn)Linc00152作為IncTNAs中的成員之一，具有參與調(diào)控細(xì)胞骨架改變的潛在功能，且在多種癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)［3］。本研究分別檢測(cè)Linc00152在LIHC癌與癌旁組織中的表達(dá)情況，并分析其與臨床病理特征及與患者預(yù)后的關(guān)系，以探索Linc00152在LIHC中的功能，并探討其作為肝癌潛在治療靶點(diǎn)的可行性。

1 資料與方法

1.1 人體組織標(biāo)本 80例人LIHC組織及其配對(duì)的癌旁組織由2012年1月至2014年1月于中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院確診為LIHC經(jīng)手術(shù)治療并經(jīng)患者簽署知情同意書后取得。以80例患者肝癌組織中Linc00152相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)（19.87）為分界線，其表達(dá)量≥19.87的患者40例，為高表達(dá)組；表達(dá)量＜19.87的患者40例為低表達(dá)組。兩組患者術(shù)前均未接受化療及放療。80例患者中，男50例，女30例；年齡37～76歲，中位年齡62歲，其中≤60歲44例，＞60歲36例；腫瘤直徑≤3 cm 50例，＞3cm 30例；術(shù)中或術(shù)后病理提示有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者14例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者66例。按國際抗癌聯(lián)盟（UICC）分期標(biāo)準(zhǔn)［4］進(jìn)行分期：Ⅰ期＋Ⅱ期50例，Ⅲ期＋Ⅳ期30例。同時(shí)取癌旁組織標(biāo)本（距離腫瘤＞2 cm）作為對(duì)照。肝癌組織及癌旁組織標(biāo)本切除后，立即應(yīng)用液氮快速冷凍儲(chǔ)存以供實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。組織病理學(xué)評(píng)估均由兩位高年資病理醫(yī)生獨(dú)立觀察，確診為LIHC并復(fù)查無誤。所有標(biāo)本檢測(cè)均經(jīng)患者及其家屬同意，并簽署知情同意書。

1.2 RNA的提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 用Trizol試劑提取組織總RNA，根據(jù)試劑盒說明書步驟進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)為20μl反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為90°10 min，95°15 s，60°1min，40個(gè)循環(huán)。采用相對(duì)定量法，測(cè)定目的基因、GAPDH的PCR產(chǎn)物的Ct值，以2-ΔΔCt計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量，每例設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。Lnc00152基因的上游引物序列為：5’-AAAATCACGACTCAGCCCCCC-3’；Inc00152基因的下游引物序列為：5’-AATGGGAAACCGACCAGACC-3’；GAPDH基因的上游游引物序列為；5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3；GAPDH基因的下游引物序列為：5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。

1.3 TCGA數(shù)據(jù)庫 通過GEPIA［5］（http：／／gepia.cancer-pku.cn）獲取TCGA 數(shù)據(jù)庫中LIHC的RNA 表達(dá)數(shù)據(jù)并分析Linc00152的表達(dá)與無生病生存時(shí)間（DFS）、總有生存期（OS）的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件和GEPIA生存分析功能。Linc00152表達(dá)水平與各臨床病理參數(shù)關(guān)系分析采用χ2檢驗(yàn)；Linc00152表達(dá)與肝癌患者OS、DFS之間的關(guān)系采用Kaplan-Meier法分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Linc00152在LIHC癌和癌旁組織中的表達(dá)情況 見圖1。

2.2 肝癌組織中Linc00152高、低表達(dá)兩組患者臨床各參數(shù)比較情況 見表1。

表1 兩組患者臨床參數(shù)比較 （例）

2.3 Linc00152在正常肝組織（距癌腫5cm以上）和肝癌組織中的表達(dá)情況 見圖2。

2.4 Linc00152在肝癌不同分期的表達(dá)情況 見圖3。

2.5 兩組患者OS與DFS比較 見表2。

表2 兩組患者OS與DFS比較 （例）

3 討論

近來隨著基因測(cè)序計(jì)數(shù)和生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，越來越多的LncRNA被發(fā)現(xiàn)與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)［6］。盡管有很大一部分LncRNA被測(cè)序和命名，僅有一少部分LncRNA有功能，且有功能的LncRNA分子機(jī)制大多需要進(jìn)一步驗(yàn)證，因此，就現(xiàn)有研究來看，探究LncRNA對(duì)預(yù)后評(píng)估的應(yīng)用價(jià)值具有可靠性。

Linc00152也稱細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)因子（CRTOR），最初在研究肝癌的發(fā)生過程中被發(fā)現(xiàn)，具有調(diào)控基因表達(dá)的功能，在多種癌癥中起關(guān)鍵的促癌作用［7，8］。Linc00152因在多種腫瘤中存在異常表達(dá)，因此倍受重視［9，10］。

在本研究中，我們首先通過大體標(biāo)本分析了LIHC癌與癌旁組織中Linc00152的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Linc00152在LIHC癌組織中的表達(dá)比較在癌旁組織中的表達(dá)明顯上調(diào)，這與Linc00152在胃癌、結(jié)腸癌、腎細(xì)胞癌等癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁組織的研究結(jié)果一致［12］。此外，我們通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析一方面驗(yàn)證了Linc00152在LIHC中高表達(dá)的情況，還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Linc00152不僅在不同分析LIHC中相對(duì)表達(dá)量存在顯著差異，而且Linc00152的高表達(dá)與LIHC患者預(yù)后呈顯著相關(guān)性。有細(xì)胞機(jī)制方面的研究從細(xì)胞分子水平驗(yàn)證了Linc00152對(duì)肺癌、腎細(xì)胞癌、肝癌等腫瘤惡性生物學(xué)行為的促進(jìn)影響［13-15］。IncRNA的促腫瘤作用可能通過IncRNA-miRNA相關(guān)的ceRNA機(jī)制或IncRNA-蛋白質(zhì)相互作用機(jī)制實(shí)現(xiàn)［16］，這仍是目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

綜上所述，Linc00152的高表達(dá)預(yù)示LIHC患者預(yù)后較差，Linc00152可能是LIHC預(yù)后檢測(cè)的分子標(biāo)志物及治療的潛在分子靶點(diǎn)，但其具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。