李晗　李昆珊　吳璐一　周志剛　黃任佳　吳煥淦　劉雅楠　黃艷　馬曉芃　劉慧榮　陸嫄

摘要 目的：維生素D（VD）缺乏與潰瘍性結腸炎（UC）發(fā)病相關，針灸對UC有顯著的療效，起效機制尚未完全闡明，因此我們從維生素D受體（VDR）及與VDR相關的p53信號通路角度，觀察針灸對UC大鼠調節(jié)的作用機制。方法：采用3%DSS制備UC大鼠模型。將大鼠隨機分為正常組，模型組，電針組，隔藥灸組和維生素D組。對雙側天樞穴采用電針或隔藥灸干預1周，維生素D灌胃1周。分析大鼠結腸黏膜形態(tài)并評分，采用免疫組織化學法和QPCR檢測結腸VDR蛋白和mRNA的表達，Western blotting檢測結腸p53、PUMA和Caspase-3蛋白的水平。結果：與正常組比較，模型組組織病理學評分顯著升高，經(jīng)電針、隔藥灸和VD干預后各組顯著降低;與正常組比較，模型組VDR蛋白和mRNA表達顯著降低，p53、PUMA和Caspase-3蛋白表達顯著升高，與模型組比較，電針組、隔藥灸組和維生素D組的VDR蛋白和mRNA表達顯著升高，p53、PUMA和Caspase-3蛋白表達顯著降低。結論：電針、隔藥灸可以顯著改善UC大鼠結腸黏膜炎性反應，該效應可能與針灸對VDR及下游p53信號通路的調節(jié)作用有關。

關鍵詞 潰瘍性結腸炎;針刺;艾灸;維生素D受體;p53信號通路

Study on the Regulatory Effects of Acupuncture on Vitamin D Receptor and p53 Signal Pathway in Ulcerative Colitis Rats

LI Han1，2，LI Kunshan1，WU Luyi1，ZHOU Zhigang3，HUANG Renjia1，WU Huangan1，LIU Yanan4，HUANG Yan1，4，MA Xiaopeng1，4，LIU Huirong1，4，LU Yuan1，4

（1 Key Laboratory of Acupuncture-Moxibustion and Immunological Effects，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200030，China; 2 The Center of Neck And Low Back Pain，Changzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Changzhou Affiliated Hospital of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine，Changzhou 213002，China; 3 International Education College，Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330004，China; 4 Department of Acupuncture and Moxibustion Immunization Laboratory，Shanghai Research Institute of Acupuncture and Median，Shanghai 200030，China）

Abstract Vitamin D deficiency has closely relationship with ulcerative colitis（UC）.Acupuncture has significant effects on UC，and the mechanism of action has not yet been fully elucidated.Therefore，we are to observe the regulatory mechanism of acupuncture on UC rats from the perspective of vitamin D receptor（VDR）and the p53 signaling pathway related to VDR.Methods：The UC rat model was prepared with 3% DSS.The rats were randomly divided into a normal group，a model group，an electroacupuncture group，a medicine-separated moxibustion group and a vitamin D group.Electroacupuncture or medicine-separated moxibustion was used to intervene in bilateral Tianshu points for one week，and vitamin D was given for gavage for one week.The morphology of the rat colon mucosa was analyzed and scored.The expression of VDR protein and mRNA in the colon was detected by immunohistochemistry and QPCR，and the levels of p53，PUMA and Caspase-3 protein in the colon were detected by western blotting.Results：Compared with the normal group，the histopathological score of the model group was significantly increased，and the groups were significantly reduced after electroacupuncture，medicine-separated moxibustion，and VD intervention; compared with the normal group，the expression of VDR protein and mRNA in the model group was significantly reduced.The expression of p53，PUMA and Caspase-3 protein was significantly increased.Compared with the model group，the expression of VDR protein and mRNA in the electroacupuncture group，the medicine-separated moxibustion group and the vitamin D group were significantly increased，and the expression of p53，PUMA and Caspase-3 protein was significantly decreased.Conclusion：Electroacupuncture and medicine-separated moxibustion can significantly improve the inflammatory response of colonic mucosa in UC rats.This effect may be related to the regulation of VDR and downstream p53 signaling pathway by acupuncture.

Keywords Ulcerative colitis; Acupuncture; Moxibustion; Vitamin D receptor; p53 signaling pathway

中圖分類號：R245文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.15.012

潰瘍性結腸炎（Ulcerative Colitis，UC）是一種目前病因未明的慢性非特異性腸道疾病，臨床表現(xiàn)為持續(xù)或反復發(fā)作的腹瀉、粘液膿血便伴腹痛、里急后重和不同程度的全身癥狀[1]。UC的治療主要采用氨基水楊酸制劑和糖皮質激素[2]，臨床上已經(jīng)取得了較好的治療效果，但是不良反應的報道也屢見不鮮。針灸作為中醫(yī)學重要的治療方法，對UC的輔助治療有確切的療效[3-6]，但起效機制尚未完全闡明。

研究表明，維生素D缺乏與UC的發(fā)生和發(fā)展存在較為緊密的聯(lián)系[7-8]。因此，國內外學者越來越重視維生素D在UC發(fā)病中的作用與意義[9-10]。我們課題組前期研究表明，隔藥灸可以顯著促進UC大鼠血清和結腸組織中維生素D及其受體（Vitamin D Receptor，VDR）的表達，降低結腸IFN-γ、TNF-α等細胞因子的表達[11]。p53基因是人體抑癌基因，目前認為p53主要調控炎性反應、腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[12]，當炎性反應發(fā)生時，p53的激活可加重炎性反應的發(fā)生。研究表明：UC模型結腸組織的p53被激活，呈現(xiàn)高表達[13]。PUMA是p53的下游靶基因，是促炎啟動基因，體內各種感染炎性反應會誘發(fā)細胞依賴p53及非依賴p53機制，誘導PUMA表達增多，且PUMA表達與UC模型內炎性反應嚴重程度呈線性關系[14]。本課題組長期致力于針灸治療UC的臨床和實驗研究，證實針灸在改善UC患者臨床癥狀，抗炎，調節(jié)免疫等方面具有顯著的優(yōu)勢[15-17]。本次研究，旨在從維生素D受體VDR和p53信號通路的角度探討針灸對UC的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 5周齡雄性SD清潔級大鼠32只，體質量（150±20）g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（滬）2012-0002，室內環(huán)境溫度控制在（20±2）℃，濕度50%～70%，照明：12 h光照/12 h黑暗。實驗中所有操作均遵循美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）及上海市實驗動物倫理委員會的規(guī)定（實驗動物倫理審批號：SZY201707014）。

1.1.2 試劑與儀器 DSS（MPBiomedicals，美國，貨號：MPbio.0216011080），骨化三醇膠丸（R.P.Scherer GmbH & Co.KG，瑞士，國藥準字J20150011），戊巴比妥鈉（Merck，德國，貨號：P-010），甲醛（上海國藥集團，貨號：M0130-2363），VDR抗體（Abcam，美國，貨號：ab3508），p53抗體（Abcam，美國，貨號：ab26），PUMA抗體（Abcam，美國，貨號：ab9643），Caspase-3抗體（Abcam，美國，貨號：ab13847）。Trizol（Invitrogen，美國，貨號：10296010），逆轉錄試劑盒（天根公司，貨號：KP203-02），SYBR GREEN熒光定量試劑盒（天根公司，貨號：FP314-02）。酶標儀（Thermo Fisher，美國，型號：MultiskanFC），石蠟包埋機（Leica，德國，型號：EG1150），切片機（Leica，德國，型號：RM2245），韓氏穴位神經(jīng)刺激儀（南京濟生醫(yī)療科技有限公司，型號：Hans-200），光學顯微鏡（OLYMPUS，日本，型號：CX23），PCR儀（ABI公司，美國，型號：2720）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 大鼠隨機選取7只作為正常組大鼠（Normal Group，N），其余25只為造模大鼠。采用3%DSS水溶液自由飲用的方法制備UC大鼠模型[18]。造模大鼠于第1周、第3周，自由飲用3%DSS水溶液，第2周、第4周，常規(guī)飼養(yǎng)。見圖1。第4周后，隨機取1只正常大鼠、1只造模大鼠進行模型鑒定。24只造模大鼠隨機分為模型組（Model Group，M），電針組（Electro-acupuncture Group，EA），隔藥灸組（Herb-partitioned Moxibustion Group，HM）和維生素D組（Vitamin D Group，VD），每組6只。

1.2.2 干預方法 正常組和模型組不做治療，只做與其他3組相同的固定，連續(xù)7 d。電針組采用一次性無菌針灸針，直刺大鼠雙側天樞穴（ST25）（臍中旁開5 mm，針刺2 mm）[19-20]，針柄連接韓氏穴位神經(jīng)刺激儀，采用疏密波，頻率2/100 Hz，電流1 mA，留針10 min，治療1次/d，共針7次。隔藥灸組予雙側天樞穴（ST25）隔藥灸，艾炷大小約90 mg;藥餅配方：附子、肉桂等，藥餅厚約0.5 cm，直徑1 cm;灸1次/d，每次每穴灸2壯，每壯燃燒時間5 min，2壯燃燒時間為10 min，共灸7次。維生素D組予1，25（OH）2D3灌胃：將0.25 μg/粒的骨化三醇膠丸（4粒）溶于15 mL的橄欖油，每只大鼠每天灌胃0.5 mL的混合液，連續(xù)灌胃7 d[21]。所有大鼠經(jīng)4%戊巴比妥鈉過量麻醉處死，取出大鼠結直腸縱行剪開，取自肛門向上6 cm腸段觀察，剪取其中1 cm置于4%多聚甲醛固定，其余置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 檢測指標與方法

1）HE染色：組織放入包埋機進行石蠟包埋，切片機連續(xù)切片（厚度為4 μm），脫蠟水化后進行蘇木素-伊紅染色，中性樹膠封片。評分參照Hofman P等人的方法[22]。2）免疫組化：結腸組織切片脫蠟水化后，采用0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖溶液進行抗原修復，自然冷卻后0.02 mol/L PBS洗3 min×3次;將玻片置于3%H2O2中，濕盒孵育10 min，0.02 mol/L PBS沖洗3 min×3次。根據(jù)說明書和預實驗結果，添加稀釋后的抗體，VDR（1∶200）。濕盒孵育，4 ℃孵育過夜，0.02 mol/L PBS沖洗3 min×3次，滴加DAB顯色液，蘇木素染色5 min，1%鹽酸乙醇分化，顯微鏡下觀察，控制染色程度，中性樹膠封片。顯微鏡下拍照，采集圖像，Image Pro Plus軟件分析累積光密度，計算IOD值。3）Western Blot：a.蛋白濃度測定：結腸組織剪碎，加入蛋白裂解液后離心，提取上清液，使用酶標儀測定蛋白濃度;b.電泳：依據(jù)說明書制備SDS-PAGE凝膠，目標蛋白樣品根據(jù)實驗所需濃度稀釋，于100 ℃沸水中水浴加熱10 min，使蛋白充分變性，上樣。冷卻至室溫，樣品于濃縮膠以80 V×30 min，于分離膠120 V×60 min跑膠分離;c.轉膜：采用半干轉。以濾紙、膠體、膜、濾紙的方式制成三明治，用電轉緩沖液浸潤后，直接置于電轉儀的正負極之間，NC膜和膠體于轉膜前置于電轉緩沖液中平衡5 min;d.封閉：5%脫脂奶粉室溫封閉1 h;e.一抗、二抗孵育：依據(jù)說明書和預實驗結果稀釋一抗（p53，1∶1 000;PUMA，1∶1 000;Caspase-3，1∶500），加入稀釋液中，4 ℃孵育過夜。一抗的膜用TBST洗滌3次，5 min/次。按照1∶1 000稀釋HRP標記的二抗，加入二抗后37 ℃孵育1 h。用TBST洗滌3次，5 min/次;f.顯色：采用ECL發(fā)光液，顯色，放入成像系統(tǒng)掃描;g.數(shù)據(jù)提?。菏褂肐mage Pro Plus軟件分析灰度值，計算目的蛋白和內參蛋白的比值，作為最終結果。4）實時定量PCR：將-80 ℃凍存的結腸組織，使用Trizol提取mRNA，經(jīng)氯仿分離、異丙醇純化、75%乙醇洗滌后，ddH2O溶解mRNA。使用逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA，使用SYBR GREEN熒光定量試劑盒于PCR儀上進行相關mRNA表達量的檢測。主要檢測直腸組織VDR mRNA的表達。具體引物設計見表1，反應條件為95 ℃預變性15 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，一共40個循環(huán)。每個樣本做2個復孔，采用公式△Ct=Ct目的基因-Ct內參基因，計算得出每個基因的△Ct，再通過換算得出每個基因相對表達量=2-△△Ct。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析，對計量資料進行正態(tài)分布檢驗，若服從正態(tài)分布，結果以均數(shù)±標準差（±s）表示;若不服從正態(tài)分布，則采用中位數(shù)（上四分位數(shù)，下四分位數(shù)）[Median（P25，P75）]表示。正態(tài)分布的資料組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），方差齊則采用最小顯著差異法（LSD檢驗）進行兩兩比較;方差不齊則采用新復極差法檢驗（Dunnett-t檢驗）進行兩兩比較。若資料不服從正態(tài)分布則采用秩和檢驗（Kruskal-Wallis test）。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 針灸可降低UC大鼠結腸組織病理學評分

正常組大鼠結腸上皮細胞形態(tài)正常，腺體排列整齊，黏膜結構完整，無組織充血、水腫和潰瘍。模型組大鼠結腸上皮結構破壞，腺體缺失，黏膜結構不完整，炎性細胞大量浸潤。與模型組比較，電針組、隔藥灸組和維生素D組大鼠結腸上皮細胞結構較完整，腺體排列較整齊，炎性細胞浸潤少。見圖2A。

病理評分顯示，與正常組比較，模型組大鼠結腸黏膜病理評分顯著增高（P<0.001），與模型組比較，電針組、隔藥灸組和維生素D組病理評分顯著減低（P<0.001）。見圖2B。

2.2 針灸可上調UC大鼠結腸黏膜VDR蛋白和mRNA表達

與正常組比較，模型組大鼠結腸黏膜VDR蛋白表達和mRNA水平顯著降低（P<0.001），與模型組比較，電針組、隔藥灸組和維生素D組VDR蛋白表達和mRNA水平顯著升高（P<0.001）。見圖3A、B、C。

2.3 針灸可上調大鼠結腸黏膜p53通路中p53、PUMA和Caspase-3蛋白表達

與正常組比較，模型組大鼠結腸黏膜p53、PUMA和Caspase-3蛋白表達顯著升高（P<0.001），與模型組比較，電針組、隔藥灸組和維生素D組的p53、PUMA和Caspase-3蛋白表達水平顯著降低，其中維生素D組p53，P<0.05，其余P<0.001。見圖4。

3 討論

形態(tài)學觀察顯示，與正常組比較，模型組大鼠結腸黏膜損傷及炎性細胞浸潤程度均較重，經(jīng)電針、隔藥灸和VD干預后，黏膜損傷和炎性細胞浸潤均顯著改善。病理評分結果，模型組較正常組評分顯著升高，3組觀察組評分較模型組均顯著降低，說明針灸可以改善UC大鼠結腸黏膜損傷，減輕結腸黏膜炎性反應。該效應是否與VDR及其相關信號通路有關是本次研究要探尋的答案。皮膚中的7-脫氫膽固醇經(jīng)由陽光中的紫外線，轉化為維生素D3，后者再經(jīng)過肝臟、腎臟的作用，在腎臟被1α羥化酶CYP27B1轉化為1，25（OH）2D3[23]。1，25（OH）2D3在細胞內與VDR結合，激活多種細胞因子，發(fā)揮生物學作用。我們發(fā)現(xiàn)模型組大鼠結腸黏膜的VDR蛋白表達與正常組比較顯著降低，這與已有的臨床研究結果一致[24]，電針，隔藥灸和維生素D均能顯著增加UC大鼠結腸的VDR表達。提示各觀察組大鼠結腸黏膜損傷的減輕與電針、隔藥灸和補充維生素D提高VDR蛋白表達有關。

由于VDR在UC發(fā)病中與炎性反應密切相關，所以我們選擇了與炎性反應調控和VDR均有關聯(lián)的p53信號通路中的部分蛋白進行觀察。研究人員采用western-blot技術，證實細胞質中p53是VDR的“結合伴侶”之一[25]。而在UC結腸組織中，Caspase-3的高表達和UC的發(fā)生、發(fā)展緊密相關[26]。Caspase-3蛋白屬于Caspase家族，是細胞凋亡最為關鍵的執(zhí)行者。在受到炎性反應等因素刺激時，即被激活。p53、PUMA在誘導細胞凋亡的過程中，引起線粒體功能障礙和Caspase-3激活，通過阻滯細胞周期、破壞細胞平衡狀態(tài)、解體細胞組織等方式進入凋亡進程。Caspase-3水平的顯著下降可以抑制細胞凋亡的發(fā)生[27]。在本項研究中，我們發(fā)現(xiàn)UC模型組大鼠結腸黏膜p53蛋白、PUMA和Caspase-3表達顯著增多，經(jīng)電針、隔藥灸和維生素D干預后，表達均顯著降低，提示電針和隔藥灸可能通過調控p53通路中的p53、PUMA和Caspase-3，介導抗炎、抑制腸上皮細胞凋亡，保護腸黏膜屏障，緩解結腸炎性反應，改善結腸黏膜潰瘍。

本研究首次以VDR為切入點，并首次通過觀察與VDR和p53通路的p53、PUMA和Caspase-3在UC大鼠結腸的表達情況，電針和隔藥灸干預后的表達情況，擬闡釋電針和隔藥灸對UC大鼠的部分起效機制。本研究結果首次發(fā)現(xiàn)，電針和隔藥灸能顯著增加UC大鼠結腸的VDR表達水平，降低p53、PUMA和Caspase-3的水平，提示該作用可能是電針和隔藥灸干預UC大鼠的起效機制之一。本研究尚存在不足之處，如受實驗條件限制，未做基因敲除等反向驗證工作，電針和隔藥灸對VDR的調控是直接作用還是間接影響不能明確，這將在后續(xù)研究中開展。

綜上所述，通過本次研究，我們發(fā)現(xiàn)電針、隔藥灸可以顯著改善UC大鼠結腸黏膜炎性反應，該作用可能與升高VDR表達水平，降低p53、PUMA和Caspase-3的表達有關。

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（2020-05-07收稿 責任編輯：徐穎）

基金項目：國家自然科學基金面上項目（81674074）——基于VDR信號通路探討艾灸對UC腸道抗菌肽的調控機制研究;上海市衛(wèi)生計生委優(yōu)秀人才培養(yǎng)計劃項目（2018YQ11）——艾灸干預潰瘍性結腸炎E3泛素連接酶TRIM31的免疫調節(jié)機制;上海市衛(wèi)生計生委科研課題青年項目（20164Y0221）——基于VDR信號通路探討艾灸對UC腸道抗菌肽的調控機制研究作者簡介：李晗（1987.03—），男，博士，主治醫(yī)師，研究方向：針灸作用機制研究，E-mail：long-1987@126.com通信作者：陸嫄（1986.12—），女，博士，助理研究員，研究方向：針灸治療炎癥性腸病的臨床與機制研究，E-mail：luyuan_sh@163.com;劉慧榮（1976.07—），女，博士，研究員，博士研究生導師，研究方向：針灸治療胃腸疾病的臨床與機制研究，E-mail：lhr_tcm@139.com