劉 利, 丁海貞, 房 偉, 畢 紅,3

(1. 安徽大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院， 合肥 230601; 2. 安徽大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 合肥 230601; 3. 現(xiàn)代生物制造安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 合肥 230601)

辣根過(guò)氧化物酶(HRP)是臨床檢測(cè)試劑中的一種常用酶，它是由棕色的鐵卟啉與無(wú)色的酶蛋白結(jié)合而成的糖蛋白，其輔基活性位點(diǎn)中含有Fe (III)。當(dāng)HRP與底物孵育時(shí)，可產(chǎn)生一種著色、熒光或發(fā)光標(biāo)記的分子衍生物，因此廣泛用于多個(gè)生化檢測(cè)項(xiàng)目和免疫類(ELISA)試劑盒[1]。酶作為一類生物催化劑，具有專一性和高效性，但受酸堿度、溫度等外界環(huán)境條件影響較大，易失活或者變性，這極大限制了酶的應(yīng)用。因此，酶的修飾和固定化就顯得非常重要，酶修飾和固定化后不僅保持酶自身的催化特性，也可改善其反應(yīng)條件等[2-3]。Shen等[4]將HRP與磁性介孔二氧化硅納米粒子以及碳點(diǎn)(CDs)復(fù)合，提供了一種能消除細(xì)胞中應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧(ROS)的方法。Hu等[5]制備了可調(diào)節(jié)漆酶活性的手性CDs，發(fā)現(xiàn)具有左旋結(jié)構(gòu)的CDs與漆酶復(fù)合后可以將漆酶的活性提高至20.2%，而右旋結(jié)構(gòu)的CDs與漆酶復(fù)合后卻將其活性降低至10.4%。CDs這一類碳納米材料因其表面富含官能團(tuán)，且具有良好的生物相容性等優(yōu)點(diǎn)使其易于與HRP等生物大分子復(fù)合。

CDs是一類具有10 nm以下尺寸的碳基納米粒子的總稱[6-7]。CDs具有尺寸小、熒光量子產(chǎn)率高、光致發(fā)光性能可調(diào)和生物相容性好等優(yōu)良特性，在化學(xué)傳感、生物顯影等方面都有很大的應(yīng)用潛力[8-9]。CDs中心一般是結(jié)晶的碳核，表面含有大量的有機(jī)官能團(tuán)，從而易于對(duì)CDs表面進(jìn)行修飾和功能化，來(lái)調(diào)節(jié)其表面結(jié)構(gòu)和光學(xué)性質(zhì)[10]。雜原子摻雜是改變CDs的光學(xué)性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)的重要手段之一，例如廣泛使用的氮(N)元素?fù)诫s[11-12]。Yang等[13]報(bào)道了氟(F)原子摻雜可以實(shí)現(xiàn)CDs的熒光發(fā)射峰(PL)紅移，這可能與F-為吸電子基團(tuán)有關(guān)。含F(xiàn)配體通常有生物惰性，這有利于避免蛋白質(zhì)變性，因此氟元素?fù)诫s也是CDs研究熱點(diǎn)之一[14-15]。此外，過(guò)氧化氫具有強(qiáng)氧化性可用作防腐劑，是許多生化反應(yīng)的重要中間體，而且高濃度的H2O2對(duì)人體有害[16]。本文研究了H2O2的加入量對(duì)F-CDs/HRP復(fù)合物催化氧化2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)的影響，旨在為碳點(diǎn)將來(lái)用于免疫熒光分析進(jìn)行前期研究。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

對(duì)苯二胺(分析純)，過(guò)氧化氫(H2O2，分析純)和ABTS(分析純)購(gòu)自阿拉丁生化科技股份有限公司；5-氟尿嘧啶(分析純)購(gòu)自薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司；油酸(分析純)和辣根過(guò)氧化酶(HRP，分析純)購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所用的水均為經(jīng)超純水機(jī)(國(guó)之源)凈化后的超純水。透射電鏡(TEM，JEM-2100型，日本)；X-射線光電子能譜儀(XPS，ESCALAB250型，美國(guó))；紫外-可見吸收光譜儀(UV-Vis，UV-1800G型，中國(guó))和熒光發(fā)射光譜儀(PL，F(xiàn)-7000型，日本)。

1.2 方法

1.2.1 F-CDs的合成

以鄰苯二胺和5-氟尿嘧啶為原料，通過(guò)一步水熱法合成F-CDs，具體合成步驟如下：稱取195 mg的鄰苯二胺和234 mg的5-氟尿嘧啶(投料摩爾比為1∶1)，加入15 mL水后超聲，使兩者溶解完全且混合均勻。把配制好的反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至內(nèi)襯四氟乙烯的50 mL不銹鋼反應(yīng)釜中，在馬弗爐中200 ℃下反應(yīng)2 h。待反應(yīng)結(jié)束后得到褐色溶液，經(jīng)過(guò)0.22 μm的濾膜抽濾，以去除產(chǎn)物中不溶的雜質(zhì)。取30 mL濾液于萃取瓶中，加入100 mL油酸，用力震蕩5 min后靜置過(guò)夜，待溶液分層后取上清液。濃縮該上清液，冷凍干燥，得到褐色的F-CDs粉末樣品，待用。

1.2.2 F-CDs/HRP復(fù)合物的制備

以醋酸-醋酸鈉緩沖溶液 (pH 4.5) 為溶劑，配制濃度為500 mg/mL的HRP溶液，備用。再以超純水為溶劑，配制一系列不同濃度的F-CDs溶液 (濃度分別為：50、75、100、125、150、200和250 μg/mL )。從每個(gè)濃度的F-CDs溶液中各取0.1 mL，另取2 mL HRP溶液，將兩者混合，在4 ℃下攪拌24 h，得到一系列的F-CDs/HRP復(fù)合物，放置于4 ℃冰箱保存。

1.2.3 F-CDs/HRP復(fù)合物催化氧化ABTS的研究

以醋酸-醋酸鈉緩沖溶液 (pH 4.5) 為溶劑，分別配制8份濃度為0.5 mmol/L、體積為700 μL的ABTS溶液，置于1.5 mL離心管中；再分別加入20 μL濃度為0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0和10.0 mol/L的H2O2溶液；然后再逐一加入10 μL濃度為250 μg/mL的F-CDs/HRP復(fù)合物溶液，混合均勻得到F-CDs/HRP-ABTS-H2O2溶液，待測(cè)。用UV-Vis光譜儀依次測(cè)試在417 nm處待測(cè)溶液的吸光度，經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)處理，得到橫坐標(biāo)為H2O2濃度、縱坐標(biāo)為待測(cè)溶液吸光度值的曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 F-CDs的形貌表征

圖1-A是制備獲得的F-CDs的TEM圖像，顯示F-CDs的形貌和尺寸均一。與之相應(yīng)的粒徑分布統(tǒng)計(jì)柱狀圖如圖1-B所示，可見F-CDs的平均尺寸約2 nm。圖1-C是單個(gè)F-CD的高分辨透射電鏡(HRTEM)圖像，其中碳核出現(xiàn)明顯的晶格衍射條紋，晶面間距為0.19 nm，對(duì)應(yīng)石墨化碳的(100)晶面，表明所合成的F-CDs具有較好的結(jié)晶性。

圖1 F-CDs的TEM圖(A)，粒徑統(tǒng)計(jì)圖(B)和HRTEM圖(C)

2.2 F-CDs的結(jié)構(gòu)表征和熒光性質(zhì)

圖2-A為F-CDs的XPS總譜，表明F-CDs表面存在C、N、O和F 4種元素，其中F含量為1.78%(原子比)，說(shuō)明有少量F原子被摻雜到F-CDs的表面。圖2-B是用高斯函數(shù)擬合分峰后的F1s譜圖，在684.93 eV[17]和687.95 eV[18]出現(xiàn)兩個(gè)峰，表明F-CDs表面摻雜的F原子存在兩種化學(xué)鍵合方式，分別對(duì)應(yīng)于半離子型C-F鍵和共價(jià)型C-F鍵。圖2-C為F-CDs的UV-Vis吸收光譜(紅線)和PL發(fā)射光譜(藍(lán)線)，顯示在262 nm處有一個(gè)明顯的吸收峰，在429 nm處還有一個(gè)較弱的吸收峰。其中262 nm處的吸收峰，可歸因于F-CDs碳核中π-π*電子躍遷[19]，而429 nm處的弱吸收峰可能與F-CDs表面基團(tuán)或雜原子摻雜有關(guān)。與之相對(duì)應(yīng)的，當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為317 nm時(shí)，F(xiàn)-CDs出現(xiàn)兩個(gè)PL發(fā)射峰：位于522 nm的主峰和位于472 nm的肩峰，說(shuō)明F-CDs可能有兩個(gè)發(fā)光中心。圖2-D中F-CDs的水溶液在可見光下呈現(xiàn)基本透明，但在紫外光照射下發(fā)出明亮的黃綠色熒光。以硫酸喹啉為參比，采用定波長(zhǎng)的方法(激發(fā)波長(zhǎng)為360 nm)，測(cè)得F-CDs的相對(duì)量子產(chǎn)率達(dá)45.6%。

圖2 F-CDs的XPS總譜(A)和F1s譜(B)，F(xiàn)-CDs水溶液的UV-Vis吸收(C)和PL發(fā)射光譜及其在日光和紫外燈照射下的數(shù)碼照片(D)Figure 2 The survey spectrum and (A) F1s XPS spectra (B)of the F-CDs， UV-Vis absorption and PL spectra (C)and the digital graphs of aqueous solution of F-CDs under daylight and UV-Vis light (D)

圖3-A、B顯示當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)從320 nm逐漸增大到460 nm時(shí)，F(xiàn)-CDs的熒光強(qiáng)度先升后降，并且發(fā)射波長(zhǎng)紅移，表明F-CDs的光致發(fā)光具有明顯的激發(fā)光依賴性。圖3-C、D顯示在激發(fā)波長(zhǎng)371 nm下，濃度依次為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0和4.0 mg/mL的F-CDs水溶液的PL光譜圖，可明顯看出隨著濃度的增加F-CDs的熒光強(qiáng)度先增后減，其發(fā)射波長(zhǎng)也發(fā)生紅移，但是當(dāng)濃度最大增加到4.0 mg/mL時(shí)，出現(xiàn)了F-CDs熒光猝滅的趨勢(shì)。圖3-E是F-CDs濃度為200 μg/mL時(shí)，與Hela細(xì)胞共培養(yǎng)4 h后的激光共聚焦顯微鏡成像的圖片，基于F-CDs優(yōu)異的光學(xué)性能可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞顯影。

2.3 F-CDs與HRP復(fù)合物分析

為探究F-CDs與HRP復(fù)合的可能性，采用PL光譜研究了F-CDs對(duì)12種金屬離子的響應(yīng)性(圖4-A)，其中陰離子均為氯離子，F(xiàn)-CDs的濃度為0.7 mg/mL，金屬離子濃度均為0.9 mmol/L。結(jié)果顯示F-CDs對(duì)Fe3+離子響應(yīng)性最大(圖4-A)，當(dāng)F-CDs與Fe3+離子復(fù)合后，其熒光強(qiáng)度下降幅度最大，表明F-CDs與Fe3+離子之間發(fā)生了電子轉(zhuǎn)移，這可能是因?yàn)镕-為強(qiáng)配體，與Fe3+離子形成穩(wěn)定的復(fù)合物。由于HRP活性中心金屬離子為Fe3+，因此F-CDs極有可能與HRP中Fe3+復(fù)合形成復(fù)合物。通過(guò)PL和UV-Vis光譜進(jìn)一步探究了F-CDs與HRP復(fù)合前后熒光強(qiáng)度和紫外-可見吸收光譜的變化(圖4-B、C)。圖4-B是相同濃度下F-CDs、HRP和F-CDs/HRP的PL光譜，可以觀察到HRP基本沒有熒光，而且與F-CDs相比，F(xiàn)-CDs/HRP的熒光強(qiáng)度略有下降，說(shuō)明F-CDs與HRP的確發(fā)生了一定程度的復(fù)合導(dǎo)致F-CDs/HRP的熒光降低，但F-CDs/HRP復(fù)合物仍具有較好的熒光性能。圖4-C是相同濃度下F-CDs、HRP和F-CDs/HRP的UV-Vis吸收光譜，F(xiàn)-CDs在260 nm和HRP在402 nm分別有明顯的吸收峰，而F-CDs/HRP復(fù)合物在260 nm和401 nm也出現(xiàn)兩個(gè)明顯的吸收峰，且強(qiáng)度較F-CDs和HRP均有所增強(qiáng)，這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步證明F-CDs與HRP形成了穩(wěn)定的復(fù)合物。

圖3 F-CDs在不同激發(fā)波長(zhǎng)(A、B)和不同濃度下的PL圖及歸一化圖(C、D)和 F-CDs與Hela細(xì)胞共培養(yǎng)后的熒光顯微鏡成像圖(E)Figure 3 PL spectra and normalized PL spectra of F-CDs at different excitation wavelengths (A, B)and different concentrations(C, D)， fluorescence microscopy images of F-CDs co-cultured with Hela cells(E)

圖4 F-CDs對(duì)金屬離子響應(yīng)圖(A)， F-CDs，HRP和F-CDs/HRP復(fù)合物的PL發(fā)射光譜(B)和UV-Vis吸收光譜圖(C)Figure 4 PL response of F-CDs to various metal ions(A)， the PL (B) and UV-Vis absorption spectra(C) of F-CDs, HRP and F-CDs/HRP

進(jìn)一步研究了在較低溫度如4 ℃下，H2O2對(duì)F-CDs/HRP復(fù)合物催化氧化ABTS的影響。當(dāng)ABTS被氧化為ABTS自由基時(shí)，在417 nm附近有明顯的吸收峰，且溶液會(huì)變成墨綠色，顏色的深淺由溶液中ABTS自由基的數(shù)量決定，故可通過(guò)溶液的顯色程度來(lái)表示ABTS被氧化的程度。當(dāng)加入H2O2的濃度較低時(shí)，F(xiàn)-CDs/HRP-ABTS混合溶液在417 nm處的吸光度值與H2O2的濃度基本成線性關(guān)系(圖5-A)，且線性擬合方程為：y=47.26x+0.0384(相關(guān)系數(shù)R2= 0.995)，可定量分析溶液中H2O2的濃度。但隨著加入H2O2的濃度越來(lái)越高，ABTS被完全氧化，此時(shí)H2O2濃度對(duì)吸光度的值就沒有太大影響。

圖5 在不同H2O2濃度下，F(xiàn)-CDs/HRP-ABTS混合溶液在417 nm處的UV-Vis吸收值，內(nèi)插圖為與之相對(duì)應(yīng)的溶液顯色情況(A)， F-CDs，HRP和F-CDs/HRP催化氧化ABTS的動(dòng)力學(xué)分析曲線(B)

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ABTS和不同濃度的H2O2共存時(shí)，混合溶液未變色即ABTS未被氧化。再加入HRP和F-CDs/HRP復(fù)合物后，溶液均有不同程度的變色，且F-CDs/HRP-ABTS-H2O2溶液比同樣條件下HRP-ABTS-H2O2溶液變色速度快，在此過(guò)程中H2O2可能起助引發(fā)劑的作用。F-CDs、HRP和F-CDs/HRP 3種物質(zhì)催化氧化ABTS的動(dòng)力學(xué)分析曲線結(jié)果(圖5-B)表明，F(xiàn)-CDs沒有催化氧化ABTS的能力，且F-CDs/HRP比HRP催化氧化ABTS的速度快，在此過(guò)程中F-CDs起保護(hù)HRP不變性進(jìn)而保持HRP較高的催化活性的作用。圖5-A中的內(nèi)插圖表明，可通過(guò)溶液顯色程度來(lái)定性分析H2O2對(duì)F-CDs/HRP中HRP活性的影響，即可初步判斷ABTS被氧化的程度。4 ℃并不是HRP催化的最佳溫度，但在H2O2存在時(shí)F-CDs/HRP復(fù)合物仍然可以迅速氧化ABTS。

3 結(jié)論

采用水熱法制備出尺寸均一且結(jié)晶性好的氟摻雜的F-CDs。F-CDs具有較好的光學(xué)性能，熒光發(fā)射具有激發(fā)光依賴性和濃度依賴性。研究還表明H2O2的量影響F-CDs/HRP催化氧化ABTS的程度。此外，4 ℃、有H2O2存在時(shí)，F(xiàn)-CDs/HRP仍具有活性來(lái)催化ABTS，可初步通過(guò)F-CDs/HRP-ABTS-H2O2溶液的顯色程度定性判斷F-CDs/HRP中HRP的活性情況。HRP與F-CDs形成復(fù)合物后不僅保持酶的活性，也具有一定的熒光性能。此工作結(jié)果為碳點(diǎn)下一步用于免疫熒光分析奠定了一定基礎(chǔ)。