王志雄，劉 慧，繆偉偉，傅珈豫，娜日蘇2，

（1.上海理工大學，上海 200093；2.馬鞍山學院，安徽馬鞍山 243100；3.日本國立大阪大學，日本大阪府吹田市 565-0871）

跨界研究和醫(yī)工融合，用工學的手段解決醫(yī)學問題已越來越多地受到研究者的關注與追捧。本研究主要是通過設計紡織品后整理劑賦予紡織品特殊的醫(yī)學功能，并利用藥學原理達到提高醫(yī)學治療效果的目的。隨著醫(yī)療手段和紡織品后整理技術的不斷進步，醫(yī)用紡織品在醫(yī)療行業(yè)中的應用越來越廣，包括普通醫(yī)用紡織品和高性能醫(yī)用紡織品。高性能醫(yī)用紡織品是指采用高科技提高產品使用性能、增加產品附加值，達到醫(yī)用目的的紡織品，如外科用非植入性紡織品［1］。而這些醫(yī)用紡織品很大一部分功能是依靠后整理劑來實現(xiàn)的。

經皮給藥系統(tǒng)（transdermal drug delivery system，TDDS）是指藥物以恒定速度（或接近恒定速度）穿過角質層，通過皮膚吸收進入全身血液循環(huán)，達到有效血藥濃度，高效率地轉送到目標組織，實現(xiàn)疾病的治療或預防［2］。為了降低皮膚天然屏障對藥物吸收的阻礙作用，目前主要采用物理方法、生物化學方法促進藥物透皮吸收。其中物理方法主要包括離子導入、電穿孔、超聲波導入和微針等，在緊急或病情嚴重的情況下，該方法能夠顯著提高藥物滲透率，提高臨床療效。但對長期用藥的患者來說，他們皮膚的天然結構會被破壞，導致部分皮膚病的發(fā)生。

聚羥基脂肪酸酯（PHA）是一種由羥基脂肪酸單體構成的高分子聚合物，由6～14 個單體碳原子組成的mcl-PHA 玻璃化溫度（Tg）低，在常溫下有黏著性［3］。由分子結構可知，PHA 主鏈具有弱親水性，側鏈具有疏水性，因此對離子型物質具有良好的分散作用［4］。前期的研究表明，mcl-PHA 能夠控制藥物釋放，并在較長時間內維持特定的物質濃度［5］；mcl-PHA 是高分子材料，不容易進入人體且可生物降解，不會對環(huán)境造成污染。因此，以mcl-PHA 作為基質制備含有pomalidomide的醫(yī)用紡織品功能后整理劑構筑pomalidomide TDDS 是可行的。選用TDDS 的優(yōu)點：（1）避開了肝臟對藥物的首過效應；（2）血藥濃度容易維持穩(wěn)定；（3）撤藥方便簡單。

FDA 批準了第一種CAR T 細胞療法，用于治療CD19 抗原陽性的復發(fā)性或難治性B 細胞急性淋巴細胞白血?。ˋLL）［6］，但CAR T 細胞療法成功治療實體瘤的報道很少。而pomalidomide（CC-4047，Actimid；Celgene Corporation，Warren，NJ，USA）是第三代免疫調節(jié)藥物，不僅可以調節(jié)T 細胞功能，還能改善腫瘤微環(huán)境［7-8］。但關于pomalidomide 與CAR T 細胞聯(lián)合治療實體瘤的報道還很少。本研究以第三代CAR T細胞CD133-CAR T 細胞［9］作為研究對象，并以U251 CD133-OE luc（轉入螢火蟲熒光素酶基因且CD133過表達的人膠質瘤細胞）作為靶細胞，探究了pomalidomide 對CD133-CAR T 細胞的調節(jié)作用，以及將mcl-PHA 用于醫(yī)用紡織品構筑的pomalidomide 經皮給藥系統(tǒng)的透皮能力。

1 實驗

1.1 材料

mcl-PHA（大阪大學藥學研究科生物工學研究室），凍存的人外周血單核細胞（PBMC）［ALLCELLS（PB005F，Alameda，CA，USA）］，pomalidomide（HY-10984，Monmouth Junction，NJ，USA）（MedChemExpress），膠質瘤細胞系U251（U251-WT）（中國科學院細胞庫）。

1.2 細胞制備

用編碼人CD133 蛋白的piggyBac 轉座子質粒和piggyBac 轉座酶載體對U251 細胞進行核轉染，通過藥篩得到過表達CD133 的細胞U251 CD133-OE。再用編碼螢火蟲熒光素酶的轉座子質粒和piggyBac 轉座酶載體再次對U251 CD133-OE 進行核轉染，并且通過藥篩獲得表達熒光素酶的腫瘤細胞株U251 CD133-OE luc。使用編碼螢火蟲熒光素酶的轉座子質粒和piggyBac 轉座酶載體對U251 細胞進行核轉染，得到U251-WT luc［10］。將表達CD133-CAR 的piggyBac 轉座子質粒和piggyBac 轉座酶載體轉入PBMC內，經激活培養(yǎng)和藥篩得到CD133-CAR T 細胞［9］。對照細胞為未轉染的T（NT）細胞，制備方法與CAR T 細胞類似，但是省去電轉和藥篩等步驟。pomalidomide的濃度為10 mmol/L，在-80 ℃下儲存，溶于二甲基亞砜（DMSO）。

1.3 測試

1.3.1 體外透皮

在室溫條件下，取10 mg mcl-PHA（溶解于氯仿中）與5 mg 模型藥物混合，均勻涂覆于聚酯薄片表面，干燥后制成TDDS 模型。在玻璃圓筒上貼上響尾蛇蛻下來的新鮮蛇皮，干燥后向玻璃圓筒里注入生理鹽水，放置一段時間后棄去生理鹽水。將制備好的TDDS 模型貼在蛇皮上，再向玻璃筒內部注入生理鹽水，構筑體外滲透研究裝置（如圖1 所示）。滲透24 h后用UV-2450 分光光度計測量生理鹽水中模型放出藥物的濃度，分析mcl-PHA 促進藥物滲透的效果，實驗至少重復3次。

圖1 體外滲透裝置

1.3.2 細胞毒性

將U251 CD133-OE luc 或U251-WT luc 腫瘤 細胞按照1×104個/孔接種到96 孔白色微孔板（PerkinElmer，Waltham，MA，USA）中，根據(jù)不同的效靶比加入CD133-CAR T 細胞，同時加入pomalidomide（藥物最終濃度分別為0.1、1.0、10.0 μmol/L），共培養(yǎng)200 μL。細胞在T 細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h 后加入0.75 mg/mL D-熒光素K+鹽（PerkinElmer，122799），并使用En-Spire Multimode 讀板儀（PerkinElmer）讀取信號值，實驗至少重復3 次。靶細胞殺傷效率p=（1-共培養(yǎng)孔的熒光值/腫瘤細胞單獨培養(yǎng)孔的熒光值）×100%，用GraphPad Prism 軟 件6.0 版（GraphPad Software，San Diego，CA，USA）對計算結果進行統(tǒng)計學處理，p小于5%即認為具有統(tǒng)計學意義。

1.3.3 細胞因子分泌水平

在96孔板中接種1×105個U251 CD133-OE luc腫瘤細胞，并按照2∶1 的效靶比加入CD133-CAR T 細胞，再加入pomalidomide使最終濃度為1 μmol/L，共培養(yǎng)200 μL，培養(yǎng)24 h。收集上清液，按AlphaLISA 試劑盒（PerkinElmer；IL-2，AL221C；IFN-γ，AL217C；TNFα，AL208C；GM-CSF，AL216C）的使用說明檢測細胞因子濃度。NT 細胞的細胞因子檢測需要將2×105個NT 細胞接種至96 孔板，并按照使用說明加入T Cell TransAct?human（Miltenyi Biotec GmbH，Cologne，NRW，Germany）激活劑，培養(yǎng)24 h，收集上清液并檢測。每種細胞因子的濃度以3 個復孔計算的均值來表示，實驗至少重復3 次，細胞因子濃度均值的計算使用Excel 完成，實驗結果使用FlowJo V-10（BD Biosciences，Bedford，MA，USA）進行處理。

2 結果與討論

2.1 體外透皮結果

觀察mcl-PHA 構筑的經皮給藥系統(tǒng)，在干燥前能均勻混合，呈透明狀，沒有發(fā)生結晶現(xiàn)象；放置一段時間后在空氣中未發(fā)生反應，性能穩(wěn)定，即mcl-PHA 構筑的經皮給藥系統(tǒng)具有良好的穩(wěn)定性。模型藥物的實驗劑量為273.24 μg/d，TDDS 在1×10 cm2面積上需要的滲透量為27.324 μg/cm2/d。由表1 可知，在mcl-PHA 基質中藥物的透皮滲透量平均值為27.867 μg/cm2/d，方差為0.450 925，說明mcl-PHA 構筑的TDDS使藥物濃度滿足實驗需要。

表1 藥物的透皮滲透量

2.2 pomalidomide 增強CD133-CAR T細胞功能

由圖2 可知，在藥物濃度相同的情況下，CD133-CAR T 細胞的殺傷效率隨著效靶比的提高而不斷升高。當效靶比為2∶1時，3種濃度的加藥組殺傷效率都有明顯提高；當效靶比為1∶1或1∶2時，只有當pomalidomide 濃度為0.1 或1.0 μmol/L 時，pomalidomide 組的殺傷效率相比DMSO 組才有明顯提高。當效靶比一定時，1.0 μmol/L pomalidomide 對CD133-CAR T 細胞的殺傷功能促進作用最強。同時，采用U251-WT luc（CD133 抗原低表達的膠質瘤細胞）作為靶細胞與CD133-CAR T細胞共培養(yǎng)后，pomalidomide對CD133-CAR T 細胞的殺傷功能沒有影響。這說明在CD133-CAR T 細胞未被激活的情況下，pomalidomide 不會誘導CD133-CAR T 細胞產生非特異殺傷作用。

圖2 pomalidomide 對CD133-CAR T 細胞殺傷功能的影響

如圖3 所示，與R10 組（培養(yǎng)基對照）相比，DMSO組IL-2（白細胞介素-2）、TNF-α（腫瘤壞死因子）、GM-CSF（粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子）和IFN-γ（γ 干擾素）的細胞因子分泌水平沒有顯著差異，但是pomalidomide 對CD133-CAR T 細胞分泌4 種細胞因子都具有明顯的促進作用。

圖3 1 μmol/L pomalidomide 對CD133-CAR T 細胞細胞因子分泌水平的影響

2.3 pomalidomide 對未轉染T細胞功能的調節(jié)

為進一步探究激活方式是否會影響pomalidomide 對T 細胞的調節(jié)作用，對未轉染的T（NT）細胞（不表達CAR）進行研究。由圖4 可知，DMSO 對NT 細胞的細胞因子分泌水平不產生作用，而pomalidomide明顯促進了NT 細胞分泌IL-2、TNF-α、GM-CSF 和IFN-γ細胞因子。

圖4 1 μmol/L pomalidomide 可提高NT 細胞分泌細胞因子的水平

3 結論

（1）pomalidomide 對CD133-CAR T 細胞的殺傷功能有明顯的促進作用，并且當pomalidomide 濃度為1.0 μmol/L 時，對殺傷功能的增強效果最明顯。但在未激活的情況下，pomalidomide 對CD133-CAR T 細胞的殺傷功能不產生影響。pomalidomide還對CD133-CAR T 細胞及NT 細胞分泌IL-2、TNF-α、GM-CSF、IFN-γ等4種細胞因子都有明顯的促進作用。

（2）pomalidomide 可以顯著提高CAR-T 細胞對腫瘤細胞的殺傷效率；pomalidomide 與CD133-CAR T聯(lián)用時，可以提高細胞的細胞因子分泌水平，并明顯改善其對腫瘤細胞的殺傷效果。因此，pomalidomide與CAR T 細胞聯(lián)用可以改善CAR T 細胞治療實體瘤的效果。

（3）響尾蛇皮結構與皮膚角質層相似，將mcl-PHA 用于醫(yī)用紡織品中構筑的Pomalidomide 經皮給藥系統(tǒng)具有藥物透皮能力，且藥物透皮量達到實驗需求。因此有望制造一種使用方便、患者易接受、藥物濃度恒定、避免肝臟首過效應和藥物在胃腸道滅活的醫(yī)用紡織品聯(lián)合細胞治療，實現(xiàn)對實體瘤的免疫治療。

（4）構筑了后整理劑-醫(yī)用紡織品-經皮給藥-疾病治療效果的閉環(huán)，達到了通過設計紡織品后整理劑賦予紡織品特殊的醫(yī)學功能，并利用藥物原理達到提高醫(yī)學治療效果的目的。這對后整理劑進入醫(yī)學領域有著特別重要的意義，也對后整理劑的拓展提供了一種方法與手段。值得注意的是，本研究更注重確定一個邏輯關系是否成立，是一個試探性研究。研究還停留在體外階段，還要進一步從體內及動物實驗中獲取數(shù)據(jù)與佐證。作為后整理劑，對于紡織品的選擇及作為醫(yī)用紡織品在紡織品性能上還要做進一步研究，才能更好地成為一種新型產品和產業(yè)。