賈艷萍，張真，佟澤為，王嵬，張?zhí)m河

（1 東北電力大學化學工程學院，吉林省吉林市132012； 2 長春工程學院能源動力工程學院，吉林長春130012）

引 言

紡織工業(yè)每年產生約2.2×109t 的廢水，其中約80%為印染廢水[1-6]。隨著新型染料、助劑的應用，印染廢水成分日趨復雜，處理難度不斷加大，亟需開發(fā)工藝簡單、運行費用低的印染廢水處理工藝。鐵碳微電解工藝是將鐵屑與活性炭浸沒于廢水中，利用鐵屑內部和鐵碳之間的電位差形成電池，產生微型電解電路與廢水中的污染物發(fā)生反應，提高廢水可生化性，這種工藝流程簡單、管理方便、運行成本低[7-12]。許多學者利用鐵碳微電解工藝處理印染廢水，污染物去除率較高。例如，Edison 等[13]采用零價鐵結合石墨工藝處理印染廢水，當進水pH為3.5、零價鐵投加量為3.5 g/L 時，色度、COD 和TOC 去除率分別為100%、67%和59%。Xingu-Contreras 等[14]采用沸石負載納米鐵工藝處理甲基橙廢水，當納米鐵與沸石比為0.06∶1、反應時間為16 h時，甲基橙去除率80%。王悅[15]采用鐵碳微電解工藝處理印染廢水，當進水pH 為3，氣水比為3∶1，鐵碳填料投加量為600 g/L 時，COD 去除率最高為67%。張禾[16]采用鐵碳微電解-Fenton 組合工藝處理印染廢水，進水pH 為4，鐵投加量為25 g/L，鐵碳質量比為1∶2，H2O2投加量為130 mg/L，COD 去除率可達80%。這些研究主要探討了運行工藝參數(shù)對污染物去除率的影響，尚不明晰鐵碳微電解工藝處理前后印染廢水生物毒性的變化。本課題組[17]前期研究發(fā)現(xiàn)，與進水相比，鐵碳微電解工藝出水的乳酸脫氫酶（LDH）和活性氧物質（ROS）含量分別下降77%及25%，細胞膜破損率及死亡率降低，對數(shù)生長期延長，初步證明了鐵碳微電解工藝影響印染廢水的可生化性和生物毒性。E.coli是生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，具有生長繁殖快、生物機體小、種群數(shù)量大、保存方便等優(yōu)點，它與高等動物有相似的物理化學特性及酶作用過程[18]。通過分析有毒污染物對E.coli 生物轉運和轉化的影響，可以反映微生物新陳代謝過程中物質、能量傳遞與生物群落的變化[19]。目前，尚缺乏利用E.coli 生物學指標的變化評價印染廢水生物毒性的系統(tǒng)研究。

本研究采用鐵碳微電解工藝處理實際印染廢水，利用E.coli 的形態(tài)、抗氧化酶系統(tǒng)、生物標志物等的變化，分析實際印染廢水經鐵碳微電解工藝處理前后的生物毒性變化，從而為實際印染廢水中的污染物達標排放提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

預處理實驗、實驗裝置見課題組前期發(fā)表文章[17,20]。

1.2 實驗用水

利用E.coli 分析對照組、進水組和出水組生物毒性的變化，對照組采用超純水配制LB 培養(yǎng)基，實驗組分別采用鐵碳微電解工藝的進水、出水配制LB培養(yǎng)基，其中鐵碳微電解工藝的進、出水組的水質指標如表1所示。

表1 進、出水組的水質指標Table 1 Water quality index of influent and effluent

1.3 分析項目和檢測方法

pH 采用pH 計（pHSJ-3F 型，上海儀電科學儀器有限公司）測定；COD、氨氮、色度及濁度采用紫外可見智能型多參數(shù)水質測定儀（LH-3BA 型，蘭州連華環(huán)?？萍加邢薰荆y定；TOC 采用總有機碳分析儀（liqui TOC Ⅱ型，德國Elementar 公司）測定；BOD5采用BOD 測定儀（M7-50A型，蘭州連華環(huán)?？萍加邢薰荆y定[21]；采用紫外-可見分光光度計（UV1700 型，上海奧析科學儀器有限公司）測定MDA、GSH、SOD、CAT及T-AOC[22]。

掃描電子顯微鏡（SEM）觀察采用場發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡（XL-30 ESEM FEG 型，美國FEI 公司），分析細胞的形態(tài)變化[23]。將超純水、鐵碳微電解工藝的進水和出水分別作為對照組、進水組和出水組。將水樣8000 r/min 離心15 min，使E.coli 的菌體沉降為菌團，棄上清液；然后加入2.5%戊二醛溶液，振蕩菌體，使之均勻分散，置于4℃環(huán)境固定2 h，8000 r/min 離心1 min 后棄上清液，采用0.2 mol/L PBS 溶液洗滌3 次；依次加入30%、50%、70%、80%、90%的乙醇，靜置15 min，8000 r/min 離心1 min，加入100%乙醇脫水2 次，靜置15 min，8000 r/min 離心1 min；將樣品置于30℃烘箱內干燥；將樣品粘于樣品臺上噴鍍金屬膜，置于樣品架上觀察細胞的形態(tài)變化。

采用N800-M生物顯微鏡（DFM55型，寧波永新光學股份有限公司）觀察吖啶橙熒光強度[24]。配制0.01 g/ml 吖啶橙溶液，加入LB 培養(yǎng)基稀釋為10-3、10-4、10-5，取E.coli 菌液1 ml 加入到1 L 的LB 培養(yǎng)基中，37℃水浴恒溫振蕩培養(yǎng)過夜，采用熒光顯微鏡觀察吖啶橙熒光強度。

E.coli 存活率采用臺盼藍拒染法分析[25]。接種處于對數(shù)生長期的E.coli，培養(yǎng)24 h，利用臺盼藍進行染色，采用光學顯微鏡（XSP-BM13C型，上海光學儀器廠）觀察，計算細胞存活率。

采用血糖儀（GA-3 型，長沙三諾生物傳感股份有限公司）測定葡萄糖含量[26]。將對照組、進水組和出水組制成1 ml的LB培養(yǎng)基，接種處于對數(shù)生長期的E.coli，加入0.1 ml 葡萄糖，30℃培養(yǎng)，9000 r/min離心1 min，取上清液測定葡萄糖濃度，并計算進水組和出水組的葡萄糖消耗量抑制率。

采用等溫量熱儀（KDHW-800A 型，深圳市萬博儀器儀表有限公司）測定熱值[27]。將E.coli于37℃培養(yǎng)24 h，以2%接種量分別接種于對照組、進水組和出水組培養(yǎng)基中，取5 ml 接種過的培養(yǎng)基加入到25 ml安瓿瓶，測定其熱值變化。

采用熒光分光光度計（RF-5301PC 型，日本島津公司）測定內源熒光蛋白和細胞膜電位。采用核酸蛋白檢測儀（HD-3001 型，上海市嘉鵬科技有限公司）測定核酸蛋白含量[28]。將對照組、進水組和出水組分別加入50 μl 菌液，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)，每隔2 h 取樣，500 r/min 離心3 min 取上清液，2000 r/min離心5 min 取下層菌體漂洗，稀釋至OD600為0.3，取5 ml 菌液，加入250 μl 的羅丹明123，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)30 min，2000 r/min 離心5 min，洗滌，分別于525 nm和340 nm測定熒光發(fā)射光譜，測得內源熒光蛋白和細胞膜電位，再將得到的E.coli 菌液，稀釋至OD600為0.1，冷凍破碎，測定核酸蛋白含量。

2 結果與分析

根據(jù)課題組前期的研究基礎[20]，鐵碳微電解工藝處理印染廢水的優(yōu)化條件為：初始pH 為4、鐵投加量為80 g/L、鐵/碳質量比為0.8、反應時間為90 min 時，COD、濁度、色度、氨氮及TOC 去除率達到最高，分 別 為75.48%、87.88%、75.34%、92.01% 及81.09%。在最優(yōu)工藝條件下進行E.coli 生物毒性實驗。

2.1 細胞形態(tài)分析

將超純水作為對照，在對照組、進水組和出水組中分別接種等量的E.coli，采用SEM 分析E.coli 表面形態(tài)的變化，結果如圖1(a)所示。由圖1(a)可知，對照組中的E.coli 呈鈍圓桿狀，細胞飽滿，細胞壁緊密，表面光滑，輪廓清晰，形態(tài)完整，細胞之間存在大量發(fā)絲狀細線連接的菌毛，加強了菌體間的機械結合力，有助于致密生物膜形成和電子傳遞[29]。進水組中的E.coli 呈破碎狀態(tài)，出現(xiàn)明顯的損傷性褶皺及孔洞，細胞兩端嚴重皺縮，毒性強的進水破壞了細胞壁和細胞膜的雙重屏障，胞內物質泄漏，細胞壞死；出水組中的E.coli 大部分為正常形態(tài)，表面略出現(xiàn)褶皺，可維持正常生命代謝活動。

吖啶橙是一類堿性熒光染色劑，具有價格低廉、可多次染色觀察及熒光強度大等優(yōu)點。吖啶橙可以透過細胞膜進入細胞內，當吖啶橙進入壞死細胞后，細胞呈橘紅色，可以根據(jù)熒光顏色的變化反映細胞的狀態(tài)[30-31]。采用吖啶橙標記的E.coli，如圖1(b)所示。對照組中熒光極少，即細胞基本無死亡；出水組中熒光較少，即細胞死亡較少，說明鐵碳微電解工藝具有降低印染廢水生物毒性的作用；進水組中熒光極多，死亡細胞發(fā)出熒光，細胞邊界不清，已解體或接近解體，說明未經處理的印染廢水毒性極強。

圖1 E.coli的微觀結構Fig.1 Microstructure image of E.coli

2.2 抗氧化系統(tǒng)分析

2.2.1 MDA 和GSH 含量 E.coli在有毒廢水中會產生高濃度的氧自由基，可攻擊細胞膜中的多不飽和脂肪酸，最終產物是MDA。MDA 可與硫代巴比妥酸發(fā)生反應，生成紅棕色的3,5,5-三甲基唑-2,4-二酮，該化合物在532 nm 處有最大吸收峰，吸收峰強度的變化可反映MDA 含量變化程度[32]。E.coli 在對照組、進水組及出水組中的MDA 含量如圖2(a)所示。由圖2(a)可知，對照組中MDA 含量無明顯變化，細胞處于正常生理代謝狀態(tài)。進水組中MDA含量急劇上升，說明印染廢水中有毒污染物含量高，大量污染物附著在細胞表面并與細胞上的不飽和脂肪酸反應，生成含有醛基、羥基和酮基等過氧化物，使細胞發(fā)生脂質過氧化反應并產生氧化損傷，因此產生大量MDA，MDA 可導致蛋白質、核酸等交聯(lián)聚合，影響膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性及流動性，其含量可反映過氧化水平，與細胞防御機制破壞程度呈正相關；后期MDA含量略有下降，細胞功能受損，與脂質過氧化作用有關的酶類被分解。出水組中MDA 含量明顯下降，鐵碳微電解工藝去除了部分有毒污染物，降低了E.coli的氧化損傷及死亡率。

圖2 MDA和GSH含量Fig.2 Content of MDA and GSH

GSH 可催化去除H2O2、超氧陰離子自由基（·）等，降低細胞氧化損傷程度[33-34]。E.coli 在對照組、進水組及出水組中的GSH含量如圖2(b)所示。由圖2(b)可知，出水組中GSH含量降低，這說明通過鐵碳微電解工藝，細胞中含巰基的酶處于較高的穩(wěn)態(tài)，避免血紅蛋白被氧自由基破壞；然而進水組中GSH 含量最高，進水污染物引起細胞的H2O2、O-2·含量升高；還原型GSH 可與5,5'-二硫代-雙-(2-硝基苯甲酸)反應，生成谷胱甘肽二硫化物(GSSG)和黃色的2-硝基-5-巰基苯甲酸，GHS 含量與被氧化程度呈負相關。

2.2.2 抗氧化酶活性分析 SOD 屬于抗氧化酶系統(tǒng)，在細胞內的活性高低可反映生物的衰老與死亡程度。SOD 活性變化可反映細胞清除氧自由基的能力。E.coli 在對照組、進水組及出水組中的SOD活性變化如圖3(a)所示。由圖3(a)可知，對照組中SOD 活性保持穩(wěn)定，出水組SOD 活性居中，經過鐵碳微電解工藝處理后的印染廢水生物毒性在一定程度上降低。而進水組中SOD 活性先是急劇上升，在有毒有害環(huán)境的脅迫下，細胞短時間之內即可作出相應的應激機制，快速合成大量SOD；SOD可清除細胞內的·、羥基自由基（HO·）及氫過氧自由基（HOO·）等，并將其歧化為H2O2和O2，即：+2H+H2O2+ O2。降低細胞內的氧自由基含量，特定抑制·的產生，對細胞的氧化及抗氧化平衡存在重要作用[35-36]。隨著時間的延長，活性氧活性升高，SOD 活性逐漸降低，細胞結構被破壞，SOD的氨基酸殘基被·OH 或H2O2氧化，產生羰基，影響細胞正常生理功能[37]。

CAT 是一種含巰基的抗氧化酶，可與谷胱甘肽過氧化物酶協(xié)同清除H2O2，減少或阻止·OH 的產生，此外可與SOD 協(xié)同降低細胞的氧化損傷[38-39]。E.coli 在對照組、進水組及出水組中的CAT 活性變化如圖3(b)所示。對照組中CAT 活性波動較小。進、出水組中CAT 活性呈先升高后降低的趨勢，這表明E.coli 在受到有毒污染物刺激后，首先產生一定的應激反應，激活CAT 活性來對抗應激反應導致的自由基增加。但是，隨著反應時間的延長，CAT活力受到抑制，從而降低了機體清除自由基和抗氧化損傷的能力[40]。CAT與SOD 活性變化趨勢基本保持一致，這也反映了在抗氧化反應中兩者協(xié)同氧化分解活性基團（ROS）的關系，這與張晶[41]的研究結論相似，其研究結果表明：SOD 和CAT 活力變化趨勢相近且聯(lián)合分解ROS。

細胞的抗氧化力與細胞生理狀態(tài)高度相關，分為以微量元素為活動中心的酶促體系和氨基酸、維生素、金屬蛋白質組成的非酶促體系，T-AOC 是評價細胞總抗氧化能力的標志物。E.coli在對照組、進水組及出水組中的T-AOC 活性變化如圖3(c)所示。由圖3(c)可知，對照組中T-AOC 活性無顯著變化。進水組、出水組的T-AOC 均出現(xiàn)先升高后降低的現(xiàn)象，這說明有毒污染物可以通過影響E.coli 的抗氧化能力而產生毒性效應。鐵碳微電解工藝通過降解污染物、減弱細胞膜受損程度及減少脂質過氧化物的產生來降低細胞損傷，主要包括3條途徑：①消除活性氧、自由基，降低脂質過氧化發(fā)生概率；②通過分解過氧化物阻斷過氧化鏈；③去除催化過程中的金屬離子[42-43]。

圖3 抗氧化酶活性對比Fig.3 Comparison of antioxidant enzyme activity

2.3 生物標志物分析

2.3.1 E.coli 存活率和跨膜電位分析 臺盼藍可與喪失活性或細胞膜不完整的細胞中的DNA 進行結合，將細胞染成藍色，而正?；罴毎膳懦馀_盼藍將其染色，因此在顯微鏡下可以快速、簡便的計數(shù)細胞的存活率。對照組、進水組及出水組E.coli 存活率的變化見圖4(a)。由圖4(a)可知，對照組、進水組及出水組的存活率約為89%、23%及61%，鐵碳微電解工藝能高效地分解酯類、醇類等污染物，將其轉化為易生化處理的小分子污染物，通過降低印染廢水中污染物的毒性，來減弱對細胞的膜系統(tǒng)及整體狀態(tài)的損害，提高細胞的存活率[20]。

E.coli細胞膜的內外電勢存在跨膜電位，羅丹明123 作為陽離子親脂性熒光染料可透過細胞膜，與細胞內膜特異性結合。羅丹明123的最大發(fā)射波長為525 nm，因此通過熒光光譜及525 nm處的熒光強度反映細胞膜電位的變化。羅丹明123染色熒光光譜如圖4(b)所示。由圖4(b)可知，對照組、出水組及進水組的最大熒光強度為103、249、445，且進水組中熒光強度最高，其原因是廢水中污染物與細胞表面接觸，發(fā)生反應使細胞膜受損或使細胞代謝紊亂死亡，細胞內容物流出，導致膜電位較高，這與萬嫦玉[28]的研究結論相似，其研究結果表明：實驗組較對照組的細胞膜電位有較大提升，其原因是細胞膜受損，溶出的Zn2+進入細胞，導致細胞膜電位上升。

圖4 E.coli存活率和羅丹明123染色熒光光譜Fig.4 E.coli survival rate and rhodamine 123 staining fluorescence spectrum

2.3.2 核酸蛋白含量和內源熒光蛋白分析 E.coli

為原核生物，擬核及細胞膜上存在少量具有轉運、孔道及調控膜通透性的蛋白質等，與細胞生命活動密切相關，因此通過測定核酸、蛋白質含量變化，可反映細胞的完整程度。細胞的核酸蛋白含量見圖5(a)。由圖5(a)可知，由于鐵碳微電解工藝降解了大部分有毒污染物，與進水組相比，出水組核酸含量升高、蛋白質含量降低；進水組中污染物引起細胞核酸損傷，導致核酸含量降低，同時污染物與蛋白質發(fā)生反應，使其空間結構發(fā)生變化，導致其變性失活，蛋白質含量升高[44]。由于核酸、蛋白質是細胞生長代謝的關鍵物質，因此廢水中有毒污染物導致細胞的物質合成能量代謝受損。

E.coli細胞內存在大量蛋白質，部分蛋白質含有可發(fā)射熒光的氨基酸即稱內源熒光，例如色氨酸、苯丙氨酸及酪氨酸等，在270～340 nm 間存在熒光吸收情況，在約340 nm 處存在最高熒光發(fā)射峰[45]。內源熒光蛋白熒光光譜如圖5(b)所示。由圖5(b)可知，對照組、出水組及進水組的最大熒光強度為719、526、247，且對照組及出水組中熒光光譜趨勢一致，進水組中熒光強度最弱，其原因可能是污染物進入細胞，與蛋白質中的氨基（—NH2）、巰基（—SH）發(fā)生反應，使得蛋白質空間結構發(fā)生變化甚至變性失活，導致其熒光特性減弱[46]。

圖5 核酸蛋白含量和內源熒光蛋白熒光光譜Fig.5 Nucleic acid protein content and endogenous fluorescent protein fluorescence spectrum

2.3.3 葡萄糖消耗量和熱值測定 葡萄糖是E.coli的主要營養(yǎng)物質，當暴露于有毒污染物時，細胞代謝會受到嚴重影響，此時葡萄糖消耗量會降低。采用血糖儀檢測培養(yǎng)液中的葡萄糖消耗量，得出對照組＜出水組＜進水組，與對照組相比，進水組與出水組葡萄糖消耗量抑制率分別為85%和47%。E.coli細胞表面帶負電荷，可與帶正電荷的污染物發(fā)生吸附作用，使細胞膜的黏滯性發(fā)生改變，導致細胞膜通透性和物質運輸交換速率發(fā)生改變，對細胞生長產生抑制作用。這與Fang 等[47]的研究結論相似，其研究結果表明：根據(jù)E.coli 的葡萄糖消耗量可準確評估其急性生物毒性，對照組中E.coli 消耗大量葡萄糖，而存在重金屬的實驗組中，E.coli代謝紊亂、葡萄糖消耗量降低。

采用等溫量熱法檢測細胞的熱值變化，37℃時E.coli 的代謝產熱曲線如圖6 所示。由圖6 可知，E.coli 發(fā)生分解、合成及其他反應的生長代謝過程中，熱量發(fā)生變化?；罴毎臒崃酷尫胖颠h大于吸收值，當處于有毒有害環(huán)境中時，可影響細胞的生長。E.coli達到放熱峰值之前處于對數(shù)生長期，細胞快速生長繁殖。對照組、出水組和進水組中代謝產熱曲線的變化規(guī)律相似，即均呈先升高后降低的趨勢，進水組和出水組熱值分別為對照組的71.20%和86.83%。因此進水組中的細胞生長最為緩慢，有毒污染物對E.coli 的代謝存在抑制作用，導致其產熱減弱，出現(xiàn)停滯期延長、生長峰后移及最大發(fā)熱功率降低的現(xiàn)象。

圖6 E.coli在37℃時代謝產熱曲線Fig.6 Metabolic heat curve of E.coli at 37℃

3 結 論

（1）通過SEM 和吖啶橙標記分析可知，進水組中的E.coli 呈破碎狀態(tài)，而出水組中的E.coli 多數(shù)為正常形態(tài)；出水組抗氧化酶系統(tǒng)中MDA、GSH、SOD、CAT、T-AOC等指標均顯著低于進水組。

（2）出水組和進水組E.coli 的葡萄糖消耗量抑制率分別為47%和85%；出水組中E.coli 的熱值和內源熒光蛋白分別升高21.95%和112.96%，核酸含量降低44.04%；進水組中E.coli 的熱值、內源熒光蛋白及核酸含量均低于出水組，蛋白質含量高于出水組。

（3）鐵碳微電解工藝能降低實際印染廢水中的生物毒性，減少細胞破損量、降低氧化損傷程度，提高廢水的可生化性。