趙雪嬌，黃亞軍，張明軍，劉兆穎

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南省獸藥工程技術(shù)研究中心，長沙 410128)

博落回，系罌粟科博落回屬植物，又名土霸王、號筒樹等，以異喹啉類生物堿為主要活性成分，具有較強的生物活性[1]。在畜牧業(yè)中，以中國傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論為基礎(chǔ)的中獸藥飼料添加劑因具有效果好、無殘留等優(yōu)點被廣泛關(guān)注。目前，作為中國首個二類中獸藥制劑的博落回散已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用，其主要活性成分為血根堿與白屈菜紅堿。隨著研究的深入，對博落回有效成分的研究也擴大了范圍，普羅托品類生物堿在畜牧養(yǎng)殖與醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。至2019年，博普總堿及博普總堿散也被成功獲批二類中獸藥，推動了我國中獸藥的現(xiàn)代化發(fā)展。

博普總堿的主要活性成分為ALL和PRO，在罌粟科、菊科、小檗科和毛茛科植物中廣泛存在，是博落回等藥用植物中的生物活性物質(zhì)[2]。ALL和PRO具有許多已證實的生物活性，ALL具有抗菌[3]、抗寄生蟲活性[4]、抗心律失常[5]和防治動物肝纖維化[6]等作用；PRO具有保肝[7]、抗寄生蟲[4]、抗血小板凝集[8]、抗血栓和抗炎[9]等作用。近年來，對ALL和PRO的代謝研究主要集中于大鼠。楊丹莉等[10,11]對大鼠血漿和各組織進行了PRO的藥效和藥代學(xué)研究，證明PRO給藥后在大鼠體內(nèi)可迅速廣泛分布和排泄。Huang等[2,12]用快速準(zhǔn)確的HPLC-QqTOF-MS方法研究了大鼠肝S9樣品中ALL和PRO的體外代謝和口服ALL和PRO后在大鼠尿液、血漿和糞便中的生物轉(zhuǎn)化，在大鼠肝S9中共鑒定出8種ALL代謝物和5種PRO代謝物，在大鼠體內(nèi)共鑒定了10種ALL代謝物和10種PRO代謝物，為ALL和PRO提供了更為全面的代謝特征。Guo等[13]研究了PRO大鼠藥代動力學(xué)、組織分布和排泄，表明PRO只有于1.0%的排泄是PRO原形，即PRO主要是作為其代謝產(chǎn)物排泄的。目前可知， ALL和PRO的生物利用度很低，在肝臟中經(jīng)歷了首過代謝，在血漿中的濃度很低，然在尿液和糞便中的殘留要高于大部分組織。因此，ALL和PRO在肝臟中的代謝機制研究就變得極為重要。為了擴大博落回在畜牧養(yǎng)殖中的應(yīng)用范圍，開展了ALL和PRO在豬肝S9中的代謝研究，根據(jù)前期對ALL和PRO代謝的研究和報道，用HPLC-QqTOF-MS對形成的代謝物進行了表征[12]。使用HPLC-MS/MS方法測定ALL和PRO在豬肝S9中的代謝物，與大鼠肝S9的體外代謝特點進行對比，總結(jié)各自的代謝規(guī)律和種屬差異。其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 ALL和PRO的結(jié)構(gòu)圖Fig 1 Structures of ALL and PRO

1 材料與方法

1.1 儀器 CF16RXⅡ型臺式高速冷凍離心機，日立工機商業(yè)有限公司；HH·S/1-2-5數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海躍進醫(yī)療器械廠；AY220型電子天平，日本Electronic Balance公司；安捷倫(1290)HPLC-(6530)QTOF液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司。

1.2 試劑 別隱品堿和原阿片堿購自湖南美可達生物資源有限公司，含量≥98%；還原型輔酶Ⅱ(NADPH)購自Roche公司；甲酸和乙腈購自上海安譜科學(xué)儀器有限公司；二甲基亞砜(DMSO)、蔗糖、乙二胺四乙酸(EDTA)和氯化鎂等試劑均為分析純，水為Milli-Q水。試劑配制見表1。

表1 試驗所需試劑的配制(保存于4 ℃)Tab 1 Preparation of reagents (stored at 4 ℃)

1.3 豬肝S9的制備 豬經(jīng)頸靜脈放血處死后，打開胸腹腔，暴露肝臟后取出，迅速吸取生理鹽水沖洗樣品表面殘血。用錫箔紙包好后立即置于液氮中充分冷卻，隨即轉(zhuǎn)入-70 ℃冰箱保存待用。試驗時，放置室溫解凍，稱取3.0 g肝組織，用Tris-HCl溶液再次清洗除去表面血液成分后，用勻漿器以1.0 g 肝組織加入4 mL Tris-HCl勻漿緩沖液的比例，制備得到肝勻漿。置于9000 G，4 ℃離心20 min取得上清液，此為肝S9。將其保存于-70℃冰箱。以上所有的操作都在冰浴上進行。

1.4 色譜和質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱為Hypersil GOLD 柱(150 mm×2.1 mm I.D.，粒徑5 μm)；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣量：5 μL；水相：0.1%甲酸水；有機相：乙腈；洗脫梯度(水相比例)：0～5 min，90%；5～20 min，90%～10%；20～25 min，10%；25.1～30 min，90%。

1.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(EIC)(正離子模式)掃描范圍50～1000 (m/z)，使用液氮作為霧化氣(流速：9 L/min，壓力：35 psig)，鞘氣溫度和流速分別為350 ℃、11 L/min，噴嘴電壓和毛細管電壓分別為1和4 kv，碰撞能量30 eV。

1.5 ALL、PRO分別與豬肝S9孵育代謝 取1.5 mL離心管，分別加入40 μL的MgCl2、豬肝S9、NADPH，反應(yīng)終濃度分別為5 mmol/L、2 mg/mL、2 mmol/L，再加入40 μL Tris-HCl溶液置于37 ℃水浴鍋中預(yù)反應(yīng)2 min，最后加入40 μL 終濃度20 μg/mL的ALL或PRO，恒溫反應(yīng)60 min。待反應(yīng)完全后，加入50 μL 15%三氯乙酸終止反應(yīng)，混勻后于4 ℃、12000 G離心15 min，取上清液過0.22 μm有機濾膜，待用。

2 結(jié)果與分析

2.1 ALL和PRO在豬肝S9中的代謝產(chǎn)物

2.1.1 ALL在豬肝中的代謝產(chǎn)物分析 使用儀器自帶軟件預(yù)測ALL在豬肝S9中的碎片離子的分子組成和分子式，研究得到4種代謝產(chǎn)物。ALL在豬肝S9的EIC和MS/MS見圖2，4種代謝產(chǎn)物見圖3。與本實驗室前期的試驗結(jié)果對比可知，分別為AL1、AL3、AL4、AL5。ALL的裂解途徑、結(jié)構(gòu)鑒定與代謝產(chǎn)物分析可詳見本實驗室前期試驗文章[12]。表2總結(jié)了ALL在豬肝S9中代謝物的保留時間、分子組成及其結(jié)構(gòu)鑒定。

圖2 ALL精確的EIC(A)和MS/MS圖(B)Fig 2 Accurate EIC (A) and MS/MS (B) of ALL

圖3 ALL在豬肝S9中代謝物AL1+AL3(A)、AL4(B)、AL5(C)的EIC圖Fig 3 Accurate EIC of metabolites AL1+AL3(A),AL4(B) and AL5(c) in pig liver S9

表2 ALL在豬肝S9中代謝物的保留時間、元素組成、實測值、預(yù)測值及鑒定結(jié)果Tab 2 Retention time, element composition, measured value, predicted value and identification results ofALL metabolites in S9 of pig liver

2.2.2 PRO在豬肝中的代謝產(chǎn)物分析 在豬肝S9中，對PRO的碎片離子的分子組成和分子式進行預(yù)測，PRO的EIC和MS/MS見圖4，代謝產(chǎn)物見圖5。研究獲得PRO的3種代謝產(chǎn)物。參考實驗室前期成果[12]可知PRO詳細的裂解途徑、結(jié)構(gòu)鑒定和代謝產(chǎn)物分析，3種代謝物分別為PR2、PR3、PR4。表3為PRO在豬肝S9中代謝物的保留時間、分子組成及其結(jié)構(gòu)鑒定。

表3 PRO在豬肝S9中代謝物的保留時間、分子式、實測值、預(yù)測值及鑒定結(jié)果Tab 3 Retention time, molecular formula, measured value, predicted value and identification results ofPRO metabolites in S9 of pig liver

圖4 PRO精確的EIC(A)和MS/MS圖(B)Fig 4 Accurate EIC (A) and MS/MS (B) of PRO

圖5 PRO在豬肝S9中代謝物PR2+PR3(A)、PR4(B)的EIC圖Fig 5 Accurate EIC of metabolites PR2+PR3(A)andPR4(B) of PRO in pig liver S9

3 討論與結(jié)論

豬肝S9中檢出了ALL的4種代謝產(chǎn)物。根據(jù)前期做過的結(jié)構(gòu)鑒定[12]，通過保留時間與實測值4種代謝物可判定為AL1、AL3、AL4、AL5，且4種代謝產(chǎn)物的含量很低，ALL在豬肝S9中主要的代謝物同大鼠肝S9一樣為AL4和AL5，這兩種代謝物在豬肝S9中的濃度約等于大鼠肝S9中代謝產(chǎn)物濃度的1/10，而AL1和AL3則略低。表明ALL在2種動物肝S9中的代謝存在著種屬差異。ALL經(jīng)環(huán)裂后產(chǎn)生的AL2在豬肝S9未檢測到。但是檢測到了其發(fā)生甲基化和O-去甲基化的代謝產(chǎn)物，這一有意思的現(xiàn)象表明在豬肝S9中AL2可能是AL3和AL4的主要來源途徑。由圖3和圖6可知，O-去甲基化在豬肝S9中是明顯的代謝途徑，其次為甲基化和氧化。亞甲二氧環(huán)環(huán)裂后的去甲基化在豬肝S9中可能是不可忽視的代謝途徑。

圖6 基于文獻[12]，ALL在大鼠和豬肝S9可能的代謝途徑Fig 6 The possible metabolic pathways of ALL in S9 of rat and pig liver based on literature [12]

豬肝S9中檢出了PRO的3種微量代謝產(chǎn)物。即PR2、PR3和PR4，且均為已報道的代謝產(chǎn)物[14,15]。對比PRO在2種動物肝S9中代謝物的EIC圖發(fā)現(xiàn)[12]，PR4代謝物的濃度在二者之間相近，但PRO在豬肝S9中的PR2和PR3代謝物濃度明顯低于大鼠肝S9中的代謝物濃度，表明PRO在2種動物肝S9中存在著種屬差異。PRO在豬肝S9的代謝率要低于大鼠，可能是在豬肝S9中生物酶催化PRO去甲基化的能力低于大鼠肝S9。同為環(huán)裂后的去甲基化，2,3-亞甲二氧環(huán)環(huán)裂后的去甲基化代謝物PR2的含量要高于9,10-亞甲二氧環(huán)的環(huán)裂后去甲基化代謝物PR3，指向PRO在豬肝S9中的主要代謝產(chǎn)物是亞甲二氧環(huán)的去甲基代謝物PR2和PR4，其次為O-去甲基化代謝物PR3。結(jié)合圖5和圖7可知，亞甲二氧環(huán)的環(huán)裂后去甲基化是PRO在豬和大鼠肝S9中的主要代謝途徑，其次為O-去甲基化。值得一提的是PR4經(jīng)代謝產(chǎn)物分析鑒定為別隱品堿，兩種生物堿之間的通過生物酶的作用進行生物轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象為普羅托品生物堿的深入研究提供方向。

圖7 基于文獻[12]，PRO在大鼠和豬肝S9可能的代謝途徑Fig 7 The possible metabolic pathways of PRO in S9 of rat and pig liver based on literature[12]

本研究采用體外肝S9體系研究了普羅托品類生物堿ALL和PRO在豬肝臟的體外代謝，在豬體外肝S9中共鑒定了7種ALL和PRO的代謝物，且均為已經(jīng)報道過的代謝物。結(jié)果表明，ALL和PRO在豬肝S9中存在低水平殘留，與大鼠肝S9的體外代謝相比均存在種屬差異，且在豬體外肝S9中的代謝率明顯低于大鼠。這一現(xiàn)象可能與代謝酶種類和數(shù)量有關(guān)。ALL和PRO在豬體外的主要代謝途徑，與大鼠的主要代謝途徑相同。二者的種屬差異暗示著藥物代謝酶ALL和PRO的關(guān)鍵酶。隨著畜牧養(yǎng)殖和醫(yī)藥領(lǐng)域的不斷應(yīng)用，以及獸藥科學(xué)的不斷發(fā)展，對普羅托品類生物堿的代謝酶機制將會有更深入的研究。