張瑞麗，李志中，孫春華，高偉，段欣強，郭文祺，韓姍姍，郝瀟雯，王恩麗，秦立廷

(山東新希望六和集團有限公司，新希望六和股份有限公司/農(nóng)業(yè)部飼料及畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點實驗室，山東青島 266000)

氟苯尼考(florfenicol)又稱氟甲砜霉素，是由美國先靈葆雅公司于 20 世紀 70 年代末研制開發(fā)的動物專用酰胺醇類廣譜抗菌藥[1]。20世紀90年代我國正式批準氟苯尼考為國家二類新獸藥[2]。目前國內(nèi)批準的氟苯尼考制劑類型較多[3]，有粉劑、可溶性粉劑、預(yù)混劑、注射液及溶液等，其中粉劑和可溶性粉劑在畜禽養(yǎng)殖過程中使用較方便，因此用量最大。但由于氟苯尼考在水中幾乎不溶，其粉劑、可溶性粉劑產(chǎn)品在臨床中的應(yīng)用受到了一定影響。針對藥物溶解性差的情況，目前國內(nèi)外已有大量提高藥物溶解度的固體制劑的研究報道[4-6]。有研究發(fā)現(xiàn)，采用分子包合、形成固體分散體等物理增溶方法來提高氟苯尼考的溶解度，可改善氟苯尼考在動物體內(nèi)的吸收，提高生物利用度[7]。于欣洋等[8]研究了氟苯尼考固體分散體在大鼠的體內(nèi)生物利用度，發(fā)現(xiàn)該固體分散體口服生物利用度與氟苯尼考原粉相比提高了15.39%。但是目前還未有氟苯尼考環(huán)糊精包合物產(chǎn)品與普通氟苯尼考粉產(chǎn)品在肉雞體內(nèi)生物利用度的比較研究。本研究建立了一種高靈敏度、高回收率的檢測血漿中氟苯尼考的UPLC-MS/MS方法，并對氟苯尼考環(huán)糊精包合物的可溶性粉(以下簡稱氟苯尼考環(huán)糊精包合粉)在肉雞體內(nèi)的藥動學(xué)特征及相對生物利用度進行了研究，以期為氟苯尼考制劑產(chǎn)品的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥品和主要試劑 氟苯尼考粉：含量20%，批號1907002，由山東某藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；氟苯尼考環(huán)糊精包合粉：含量20%，批號1907002，由山東某藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；氟苯尼考對照品：購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，含量99.1%，批號K0301703；甲醇，色譜純，美國天地試劑有限公司；乙酸乙酯，色譜純，美國飛世爾試劑有限公司；超純水由MilliQ凈化系統(tǒng)制得，Millipore公司。

1.2 溶液配制 氟苯尼考對照品儲備液：精密稱取氟苯尼考對照品適量，用甲醇制成含氟苯尼考1 mg/mL的對照品儲備液，-20 ℃避光保存?zhèn)溆?。氟苯尼考對照品工作液：量取適量的1 mg/mL的對照品儲備液，用甲醇-水(1∶4)稀釋并配制成100 μg/mL工作溶液，-20 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要儀器設(shè)備 三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀，AB SCIEX Triple QuadTM4500，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；BEH X-bridge C18(2.1 mm×50 mm，2.5 μm)，美國沃特斯科技有限公司；TDL-5A離心機，江蘇金怡儀器科技有限公司；MTN-2800D氮吹儀，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；XW-80A型連續(xù)旋渦混合器，海門市其林貝爾公司；SB-4200DTD型超聲波清洗儀，寧波新芝生物科技有限公司。

1.4 實驗動物 健康白羽肉雞24 只，體重為1～1.5 kg，飼喂不含藥物添加劑及抗生素的定制肉雞飼料，正常預(yù)飼一周，試驗前采血檢測血漿中是否有氟苯尼考藥物干擾。給藥前禁食12 h，自由飲水，給藥后禁飼4 h。

1.5 給藥與采樣 24只白羽肉雞，按照體重隨機分為A、B兩組，A組每只雞單劑量經(jīng)口灌服20%氟苯尼考粉，B組每只雞單劑量經(jīng)口灌服20%氟苯尼考環(huán)糊精包合粉，兩組灌服劑量均為20 mg/kg(給藥前加適量水溶解后灌服)；灌服給藥后，采樣時間點為給藥前及給藥后0.083、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h。每個時間點采集翅靜脈血1～2 mL，置5 mL用肝素鈉潤洗的聚丙烯塑料離心管中，混勻， 3000 r/min離心10 min，分離血漿，置-80 ℃冰箱保存。

1.6 試驗方法

1.6.1 色譜分析條件 色譜柱：BEH X-bridge C18(2.1 mm×50 mm，2.5 μm)；流動相：A相為水，B相為甲醇；梯度洗脫條件見表1；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL。

表1 流動相條件Tab 1 Conditions of mobile phase

1.6.2 質(zhì)譜分析條件 采用電噴霧負離子掃描的方式，多反應(yīng)監(jiān)控(MRM)，電噴霧離子源(ESI)。母離子、子離子、碰撞能量、加速電壓等質(zhì)譜條件見表2。

表2 氟苯尼考質(zhì)譜條件Tab 2 Mass spectrometry of florfenicol

1.6.3 血漿樣品的前處理 準確吸取0.5 mL血漿于10 mL離心管中，加入4 mL乙酸乙酯，渦旋1 min，超聲提取20 min，3000 r/min離心10 min，取2 mL上層乙酸乙酯上清液，氮氣吹干，殘留物用5 mL甲醇-水溶液(1∶4)溶解，渦旋1 min。部分采樣點的樣品需再進行10～20倍稀釋，稀釋后進樣。樣品溶液經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾后，進行UPLC-MS/MS分析。

1.6.4 檢測限及定量限 空白樣品中添加已知濃度的氟苯尼考對照品工作液，使添加濃度依次降低，按照優(yōu)化出的血漿樣品預(yù)處理方法處理，重復(fù)操作5次，經(jīng)測定，以能達到信噪比S/N≥3時樣品的最低濃度為血漿中的檢測限(LOD)，以能達到信噪比S/N≥10時樣品的最低濃度為血漿中的定量限(LOQ)。

1.6.5 準確度和精密度 準確吸取濃度為 10、2、0.5 μg/mL系列對照品工作液各 100 μL，添加到 500 μL 的空白血漿中，渦旋 1 min 混勻，配制成含氟苯尼考血漿終濃度分別為10、2、0.5 μg/L 的含藥血漿樣品，按照“1.6.3”項下的血漿樣品前處理方法進行處理，每個濃度處理 5 個平行樣品，與同濃度的對照品工作液產(chǎn)生的響應(yīng)值相比較，測定準確度和精密度。

1.6.6 標準曲線及線性范圍 精確量取適量的氟苯尼考對照品工作液，依次用甲醇-水溶液(1∶4)稀釋成氟苯尼考含量為50、20、10、5、2、1、0.5、0.1 μg/mL系列工作液。精確吸取空白血漿500 μL加入10 mL離心管中，再分別依次加入100 μL上述系列工作液，使氟苯尼考血漿終濃度分別為50、20、10、5、2、1、0.5、0.1 μg/L。上述樣品按照“1.6.3”項下的血漿樣品前處理方法處理后，每個濃度配制3個平行樣品，進行 UPLC-MS/MS 檢測，根據(jù)儀器分析結(jié)果及相關(guān)系數(shù)，制作標準曲線。

1.7 數(shù)據(jù)處理 采用EXCEL繪制血藥濃度-時間曲線。采用WinNonlin5.2.1 軟件處理血漿藥物濃度-時間數(shù)據(jù)，用非房室模型統(tǒng)計矩原理計算藥代動力學(xué)參數(shù)。按公式計算兩種氟苯尼考粉的相對生物利用度F，F(xiàn)= AUCB/ AUCA

式中，AUCA為受試藥A的藥時曲線下面積；AUCB為受試藥B的藥時曲線下面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)驗證

2.1.1 線性結(jié)果 以氟苯尼考的濃度為橫坐標，氟苯尼考的離子峰面積為縱坐標，建立標準曲線。結(jié)果顯示，氟苯尼考在0.1～50 μg/L的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其線性方程Y=2.096e5X-1086.04，r=0.9990。

2.1.2 方法回收率與精密度 結(jié)果見表3。由表3可知，氟苯尼考在血漿樣品中 10、2、0.5 μg/L 3個添加濃度水平下，其回收率在75%～110% 之間，日內(nèi)和日間變異系數(shù)均小于15%，符合《獸用化學(xué)藥物臨床藥代動力學(xué)試驗指導(dǎo)原則》中對于回收率和精密度的要求。

表3 血漿中氟苯尼考回收率和精密度考察試驗結(jié)果Tab 3 Recovery and precision test results offlorfenicol in plasma

2.1.3 方法檢測限及定量限 氟苯尼考的檢測限為0.025 ng/mL，定量限為0.05 ng/mL。

2.2 藥動學(xué)結(jié)果

2.2.1 藥時曲線 肉雞灌服2種氟苯尼考制劑后，各給藥組的平均血藥濃度-時間曲線見圖1。由圖1可知，氟苯尼考在肉雞體內(nèi)吸收迅速，在2 h內(nèi)可達到最大血藥濃度；B組氟苯尼考環(huán)糊精包合粉的Cmax和AUC要顯著大于A組氟苯尼考粉。

圖1 肉雞灌服氟苯尼考20mg/kg(FBNK)后平均藥時曲線圖(n = 12)Fig 1 Mean plasma concentration-time curves ofFBNK after oral administration of FBNK tobroilers at 20mg/kg (n = 12)

2.2.2 藥動學(xué)參數(shù) 采用WinNonlin5.2.1 軟件處理數(shù)據(jù)，用非房室模型統(tǒng)計矩原理計算藥代動力學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表4，A、B兩組的T1/2λz分別為4.814±3.058 h、2.106±1.476 h;Tmax分別為1.563±0.755 h、1.417±1.683 h；Cmax分別為1043.15±391.42 ng/mL、4691.95±1597.28 ng/mL；AUClast分別為4283.53±2406.81 h·ng/mL、14911.70±2976.22 h·ng/mL；MRTlast分別為4.799±2.124 h、3.032±1.535 h。

表4 肉雞灌服氟苯尼考后的藥動學(xué)參數(shù)Tab 4 Non-compartmental pharmacokinetic parametersof florfenicol in broilers plasma after oraladministration of 20 mg/kg (n=12)

2.3 生物利用度結(jié)果 按照1.7項下公式計算氟苯尼考環(huán)糊精包合粉的相對生物利用度。結(jié)果表明，采用環(huán)糊精包合工藝的氟苯尼考粉的相對生物利用度為348.12%。

3 討論與結(jié)論

3.1 血漿樣品的前處理方法 在樣品前處理過程中，部分樣品在乙酸乙酯吹干后用甲醇-水溶液(1∶4)振搖溶解時，并不能完全溶解，可能會造成樣品中氟苯尼考檢測結(jié)果偏低；為此可在樣品中加入約1～2 mL正己烷，然后加入甲醇-水溶液(1∶4)振搖，底部樣品可被溶解，溶液分層，吸取下層溶液進樣，可避免氟苯尼考含量的損失。

3.2 氟苯尼考藥動參數(shù)分析 藥動學(xué)研究結(jié)果顯示，采用環(huán)糊精包合工藝的氟苯尼考與普通工藝氟苯尼考產(chǎn)品之間的T1/2λz、Tmax均不存在顯著差異(P>0.05)，而Cmax、AUClast經(jīng)統(tǒng)計分析后差異顯著(P<0.001)，表明經(jīng)過環(huán)糊精包合后的氟苯尼考在體內(nèi)吸收更好，血藥濃度及藥時曲線下面積顯著提高。

本研究得到的藥動學(xué)參數(shù)MRT與劉芳報道[9]的類似，而其他藥動參數(shù)Tmax、Cmax、AUClast均存在一定的差異，這可能與劉芳選用的試驗動物為黃羽肉雞，而本試驗選擇的試驗動物為白羽肉雞有關(guān)；而且本試驗選擇的制劑與劉芳研究選用的兩種氟苯尼考制劑(含量規(guī)格分別為10%、20%)工藝也不同。

3.3 氟苯尼考生物利用度分析 原料藥粒徑及制劑工藝的改變，均可能影響氟苯尼考藥物的生物利用度。Xu Y等[10]研究了利用熱熔擠壓技術(shù)制備的氟苯尼考腸溶制劑的生物利用度，結(jié)果顯示其生物利用度為普通商業(yè)制劑的117.2%。王加才等[11]研究了超微粉碎后氟苯尼考的生物利用度，結(jié)果與原藥相比，超微粉碎后的氟苯尼考體內(nèi)吸收加快，生物利用度增加。目前市面上的普通的氟苯尼考粉基本是采用氟苯尼考和輔料簡單混合后得到的產(chǎn)品，而環(huán)糊精包合的氟苯尼考粉，則利用了環(huán)糊精具有較大的空穴結(jié)構(gòu)[12]可以將氟苯尼考包合在內(nèi)的特點，提高了氟苯尼考的溶解度。本研究所用的環(huán)糊精包合的氟苯尼考全部為環(huán)糊精包合物，不是與環(huán)糊精的混合物或部分包合物。研究結(jié)果表明了氟苯尼考環(huán)糊精包合物的相對生物利用度明顯高于普通氟苯尼考粉。本試驗氟苯尼考的灌胃劑量為20 mg/kg，遠遠低于胡曉軍[13]研究的肉仔雞服用氟苯尼考的半數(shù)致死量 LD50(10392.02 mg/kg),且氟苯尼考的環(huán)糊精包合物在肉雞體內(nèi)的最大血藥濃度均小于10 ng/mL。在本試驗結(jié)束后對試驗雞只持續(xù)觀察一周，并未發(fā)現(xiàn)有明顯的不良反應(yīng)。

根據(jù)研究結(jié)果，在臨床使用不同制劑工藝的氟苯尼考時，需要綜合考慮藥物在動物體內(nèi)的藥動學(xué)特征以及生物利用度；不同制劑工藝的產(chǎn)品不可同等應(yīng)用，比如在耐藥性嚴重的地區(qū)使用普通氟苯尼考粉治療時，由于其血藥濃度較低，其治療效果不如氟苯尼考環(huán)糊精包合物產(chǎn)品。關(guān)于氟苯尼考環(huán)糊精包合物產(chǎn)品的臨床實際應(yīng)用效果需要進一步試驗研究。