張璐，龔旭昊，趙富華，范強

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

白頭翁口服液由白頭翁、黃連、秦皮、黃柏4味藥組成，具有清熱解毒，涼血止痢的功效[1]。處方中君藥黃連起主要藥效作用，且價格較貴。黃連的主要有效成分為生物堿類[2]。為避免某些企業(yè)因節(jié)約成本，不投、少投、投劣質(zhì)黃連[3]，更好控制白頭翁口服液質(zhì)量，建立了同時測定白頭翁口服液中3種生物堿成分的高效液相色譜法。鑒于多指標(biāo)的質(zhì)量控制模式需要對照品的種類和數(shù)量較多，且部分對照品(如鹽酸黃連堿)價格較貴，參照《一測多評法建立的技術(shù)指南》[4]要求，以鹽酸小檗堿為內(nèi)參物，建立鹽酸小檗堿與鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀間的相對校正因子(fsi)及相對保留時間，并計算各成分的量，達到使用1種對照品對多種成分進行同步定量測定的目的。同時采用外標(biāo)法同步測定，驗證一測多評法所得結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑 Waters 2695高效液相色譜儀，Waters 2998 PDA檢測器，Empower色譜工作站軟件；電子分析天平：感量0.00001 g；KQ3200型超聲波清洗器；乙腈，色譜純，購自默克公司；甲醇、鹽酸等試劑均為分析純，購自國藥化學(xué)試劑有限公司；水由實驗室MILLIPORE超純水儀自制。

1.2 試藥 鹽酸小檗堿對照品(批號 Z0221507)，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；鹽酸黃連堿對照品(批號112026-201802)、鹽酸巴馬汀對照品(批號 110732-201812)均購自中國食品藥品檢定研究院。白頭翁口服液分別購自北京、山東等地。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定方法的建立及方法學(xué)考察

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液(50∶50)(每100 mL中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，再以磷酸調(diào)節(jié)pH為4.0)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：347 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.1.2 對照品儲備溶液的制備 取鹽酸黃連堿對照品、鹽酸巴馬汀對照品、鹽酸小檗堿對照品各約10 mg，精密稱定，分別置25 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為鹽酸黃連堿對照品儲備溶液、鹽酸巴馬汀對照品儲備溶液、鹽酸小檗堿對照品儲備溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密量取供試品溶液2 mL，置50 mL量瓶中，加入甲醇-鹽酸(100∶1)的混合溶液適量，超聲10 min，放置至室溫，加甲醇-鹽酸(100∶1)的混合溶液稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.1.4 陰性供試品溶液的制備 實驗室照白頭翁口服液制法自制，即取白頭翁30 g、秦皮30 g，每次加水100 mL煎煮，煎煮3次，合并煎液，濾過，濾液加入乙醇，使含醇量達到75%，靜置12 h，濾取上清液回收乙醇，加水調(diào)至97.5 mL，即得。

2.1.5 專屬性試驗 分別吸取陰性供試品溶液、各對照品溶液、供試品溶液各10 μL，照“2.1.1”項下色譜條件測定。鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿與相應(yīng)的對照品色譜峰保留時間一致，達到基線分離。陰性供試品溶液色譜中與各成分峰相應(yīng)的保留時間處無吸收峰，表明制劑中其他成分對測定無干擾，結(jié)果見圖1。

2.1.6 檢測波長的選擇 照“2.1.1”項下色譜條件，分別進樣對照品溶液和供試品溶液，所得紫外吸收光譜圖見圖2。綜合《中國獸藥典》2015年版二部中黃連含量測定項下345 nm的檢測波長，選擇347 nm作為白頭翁口服液含量測定的測定波長。

2.1.7 線性關(guān)系考察 精密量取鹽酸黃連堿對照品儲備溶液、鹽酸巴馬汀對照品儲備溶液、鹽酸小檗堿對照品儲備溶液適量，置量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成0.5、1、2.5、5、10、20 μg/mL 6個濃度的混合對照品溶液，濾過，分別進樣10 μL，測定。以對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿回歸方程(n=6)：Y=79669X+2867.4，r=1.00；Y=76963X+2281.4，r=1.00；Y= 77018X+ 3179，r=1.00。結(jié)果表明，鹽酸黃連堿在0.5～20 μg/mL、鹽酸巴馬汀在0.5～20 μg/mL、鹽酸小檗堿在0.5～20 μg/mL范圍內(nèi)，峰面積與溶液濃度線性關(guān)系良好，見圖3。

a.陰性供試品溶液；b.鹽酸黃連堿對照品溶液；c.鹽酸巴馬汀對照品溶液；d.鹽酸小檗堿對照品溶液；e.供試品溶液a.Negative sample solution; b.Coptisine hydrochloride reference solution；c.Parmatine hydrochloride reference substance solution;d.Berberine Hydrochloride Reference Solution; e.Test solution圖1 高效液相色譜圖Fig 1 The high performance liquid chromatogram

2.1.8 精密度試驗 精密吸取“2.1.7”項下的同一混合對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，結(jié)果鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為0.33%、0.49%、0.53%，表明方法精密度良好。

2.1.9 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別在0、6、12、24 h進樣測定，記錄峰面積，結(jié)果鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為0.20%、0.62%、0.14%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.10 重復(fù)性試驗 精密量取同一供試品6份，分別照“2.1.3”項下方法制備成供試品溶液，照“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，測得鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的平均含量分別為33.16、122.88、225.68 μg/mL，RSD分別為0.36%、0.20%、0.21%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.11 定量限與檢出限 精密吸取“2.1.2”項下的對照品儲備溶液，取適量混合并逐步稀釋，取稀釋后溶液進樣檢測。按照10倍噪音計算定量限，鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的定量限濃度均為0.20 μg/mL；按照3倍噪音計算檢出限，鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的檢出限濃度均為0.10 μg/mL。

2.1.12 回收率試驗 供試品溶液中鹽酸黃連堿的量為66.31 μg、鹽酸巴馬汀的量為245.77 μg、鹽酸小檗堿的量為451.36 μg。添加等量對照品，鹽酸黃連堿添加量為65.00 μg，鹽酸巴馬汀添加量為240.00 μg，鹽酸小檗堿添加量為450 μg，各平行6份，照“2.1.1”項下色譜條件測定，計算加標(biāo)回收率(表1)。其中，鹽酸黃連堿的平均回收率為99.34%，RSD值為0.67%；鹽酸巴馬汀的平均回收率為97.20%，RSD值為0.31%；鹽酸小檗堿的平均回收率為98.72%，RSD值為0.25%。上述試驗表明該方法回收率高。

(a)鹽酸黃連堿紫外吸收光譜；(b)鹽酸巴馬汀紫外吸收光譜；(c)鹽酸小檗堿紫外吸收光譜(a) Ultraviolet absorption of coptisine hydrochloride；(b) Ultraviolet absorption of parmatine hydrochloride；(c) Ultraviolet absorption of berberine hydrochloride圖2 紫外吸收光譜圖Fig 2 The ultraviolet absorption spectrum

(a)鹽酸黃連堿線性關(guān)系圖；(b)鹽酸巴馬汀線性關(guān)系圖；(c)鹽酸小檗堿線性關(guān)系圖(a) Linear diagram of coptisine hydrochloride；(b) Linear relationship diagram of palmatine hydrochloride；(c) Linear relationship diagram of berberine hydrochloride圖3 各成分線性關(guān)系圖Fig 3 Linear relationship diagram of each component

表1 加標(biāo)回收率試驗數(shù)據(jù)表Tab 1 Sample recovery rate test results

2.2 相對校正因子的確定

2.2.1 相對校正因子的計算 取“2.1.7”項下配制的6份混合對照品溶液，每個濃度平行進樣2針，分別以鹽酸黃連堿峰面積、鹽酸巴馬汀峰面積與鹽酸小檗堿峰面積的比值的平均值作為相對校正因子，按下式計算：

(1)

式中As為內(nèi)參物對照品(鹽酸小檗堿)s峰面積，Cs為內(nèi)參物對照品(鹽酸小檗堿)s濃度；Ai為待測成分對照品(鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀)i峰面積，Ci為待測成分對照品(鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀)i濃度。計算得到相對校正因子f黃連堿/小檗堿=1.02，RSD值為1.18%；f巴馬汀/小檗堿=1.00，RSD值為0.61%。

在測定含量時，內(nèi)參物(鹽酸小檗堿)s的濃度可按常規(guī)方法進行測定(Cs)，應(yīng)用fsi，結(jié)合內(nèi)參物(鹽酸小檗堿)s實測值Cs，計算待測成分(鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀)i的濃度，按下式計算：

(2)

式中Ai為供試品中待測成分i的峰面積，Ci為供試品中待測成分i的濃度，As為供試品中內(nèi)參物s的峰面積，Cs為供試品內(nèi)參物s的濃度，fsi為內(nèi)參物s對待測成分i的校正因子。

2.2.2 相對保留時間的確定 取“2.1.4”項下配制的混合對照品溶液，采用四種色譜柱：Agilent ZORBAX SB C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、資生堂MGⅡ C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Waters Xbridge C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、資生堂MGⅡ C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；采用三種流動相比例：有機相-水相(52∶48)、有機相-水相(50∶50)、有機相-水相(48∶52)；采用三種流動相pH值：3.8、4.0、4.2；采用三種柱溫：25 ℃、30 ℃、35 ℃，分別以鹽酸黃連堿峰保留時間、鹽酸巴馬汀峰保留時間與鹽酸小檗堿峰保留時間的比值的平均值作為相對保留值，計算待測成分出峰位置。得到相對保留時間值r鹽酸黃連堿/鹽酸小檗堿=0.74，RSD值為1.24%；r鹽酸巴馬汀/鹽酸小檗堿=0.90，RSD值為1.05%，結(jié)果見表2。

表2 相對保留時間Tab 2 Relative retention time

2.3 一測多評法與外標(biāo)法的比較 精密吸取9批白頭翁口服液各2 mL，分別照“2.1.3”項下方法制備成供試品溶液，進樣測定，記錄峰面積。采用常規(guī)外標(biāo)法和一測多評法計算各成分的含量。各成分含量相對偏差見表3。外標(biāo)法與一測多評法計算所得的各成分含量的相對偏差均≤3.26%，符合《一測多評法建立的技術(shù)指南》中樣品含量計算值與實測值間相對偏差<5%的考量尺度。

表3 兩種方法所測結(jié)果比較Tab 3 Comparison of the results measured by the two methods

3 結(jié)果與討論

一測多評法是利用中藥有效成分間的內(nèi)在函數(shù)和比例關(guān)系，以樣品中某一典型成分為內(nèi)參物，建立其與其他待測成分間的相對校正因子，通過相對校正因子，計算得其他待測成分的含量，從而實現(xiàn)測定一個代表性成分同步監(jiān)測多個指標(biāo)性成分的目的[5]。鹽酸小檗堿對照品來源充足，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在藥材中含量高，故選擇鹽酸小檗堿作為內(nèi)參物能夠充分體現(xiàn)一測多評法低成本高效率的優(yōu)勢[6]。

在一測多評法中，色譜系統(tǒng)誤差是影響其準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素。色譜系統(tǒng)誤差因素包括流動相的組成比例、pH值、柱溫、流速、色譜柱類型等。研究中采用相對保留時間值對待測組分色譜峰進行定位，分別從4種不同品牌色譜柱、不同流速、柱溫等因素對相對校正因子和相對保留時間的重復(fù)性進行考察，結(jié)果RSD均<2%，表明建立的一測多評法系統(tǒng)適用性較好。

將一測多評法應(yīng)用于白頭翁口服液的質(zhì)量評價體系中，具有快速、簡便、低成本等優(yōu)點，可有效應(yīng)對化學(xué)對照品昂貴、檢驗過程繁瑣復(fù)雜的局面，為白頭翁口服液質(zhì)量控制提供了新的思路與數(shù)據(jù)支撐。